[发明专利]一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法

权利要求书

1.一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、构建亚细胞定位载体pCAMBIA2300-GFP和其重组载体，将亚细胞定位载体pCAMBIA2300-GFP和其重组载体、辅助质粒P19分别转入三株EHA105农杆菌菌株中；

S2、分别挑取转入载体/质粒后的单菌株加入三个1mL含50mg/Lkan和25mg/Lrif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养；以农杆菌菌液与YEB液体培养基体积比1：100，将过夜培养后的农杆菌菌液加入20mL含50mg/Lkan和25mg/Lrif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养；

S3、将经过两次过夜培养后的三个YEB液体培养基中的农杆菌菌液经3000rpm离心5min后去上清，分别以侵染液进行悬浮，将载体菌液与辅助质粒菌液以1：1混合，28℃黑暗孵育2-4h，得到孵育好的侵染液；

S4、取百合茎尖处幼嫩叶片，取合适大小的纱布，叶片底部放一块干净的鹅卵石，将叶片和鹅卵石包裹起来，放入50mL烧杯中，加入孵育好的侵染液；抽真空，之后将叶片置于无菌水中清洗3-4次；

S5、培养皿中垫入5张滤纸，以10％的蔗糖溶液浸湿，将清洗后的百合叶片正面朝上摆入培养皿中，并以10％的蔗糖溶液喷施；22℃黑暗培养1d，见光培养1-2d；将叶片放入青霉素小瓶中，加入10μg/mL的DAPI溶液，用注射器进行抽气，直至叶片沉入瓶底，于37℃黑暗孵育20min，1×PBS清洗4-5次；

S6、用镊子轻轻刮去百合叶片叶肉组织，获得叶片下表皮，将其制片后在激光共聚焦显微镜下，分别以488nm和340nm激发波长观察GFP和DAPI信号。

2.根据权利要求1所述的一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，其特征在于：所述S1中，将辅助质粒P19转入EHA105农杆菌菌株的具体步骤为：

S1-1、取2μL辅助质粒P19，加到50μL冰水混合状态的EHA105农杆菌菌株的感受态细胞中，冰上静置30min；

S1-2、于液氮中速冻2min，转入37℃水浴锅中进行热激5min；

S1-3、热激后加入700μL无抗YEB液体培养基中，于28℃摇床200rpm复苏3h；

S1-4、3000rpm离心2min，吸去600μL上清后吹打混匀，取100μL涂布于含50mg/Lkan和25mg/Lrif抗性的YEB平板上，28℃倒置培养2d。

3.根据权利要求1所述的一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，其特征在于：所述S3中，以含10mM MES的侵染液和含10mM MgCl₂和150μMAS的侵染液分别对含载体/质粒的农杆菌菌液进行悬浮，调节OD₆₀₀至0.8。

4.根据权利要求1所述的一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，其特征在于：所述S4中，以-80Kpa进行抽真空5min，放气5min，重复抽真空、放气3次。