[发明专利]一种VRA-NAG底物法检测NAG的技术及试剂

说明书

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种VRA‑NAG底物法检测NAG的技术及试剂。本发明提供的NAG检测试剂的线性范围可达(0，500]U/L；在范围内，当抗血酸≤340μmol/L，尿素≤42.9mmol/L，尿酸≤1.4mmol/L，白蛋白≤100mg/dL，胆红素≤342μmol/L，乳酸≤6.6mmol/L，葡萄糖≤55mmol/L，甘油三酯≤37mmol/L，草酸≤81μmol/L时，这些组分对测试无明显干扰。并且，检测试剂加速老化10天造成的相对标准偏差不超过±10％。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、特异性强，且稳定性好，有利于临床对肾脏疾病的早发现早治疗。

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种VRA-NAG(5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-饶丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶)底物法检测NAG的技术及试剂。

背景技术

葡萄糖苷酶(NAG)是一种人体内比较重要的溶酶体水解酶，相对分子质量为130～140KD，在血浆中半衰期仅为5分钟。NAG广泛存在于人体内，当肾功能损害会造成溶酶体破裂释放NAG，使NAG指标数值增高，NAG测试值可以非常敏感地反映肾的损伤。肾小球不能滤过血浆中的NAG，近年来，尿液中NGA的含量成为较为理想的监测肾脏病变的指标，检测尿NGA的含量具有临床实用性。

现有的NAG检测技术较多，主要包括荧光分光光度法和紫外分光光度法。其中荧光分光光度法需要昂贵的仪器和底物溶液，不适宜作为普通医院的常规检测方法。

基于需求，发展出来许多快速廉价的紫外分光光度检测法，如CNP-NAG法、PNP-NAG法、MNP-G1CNAc法和VRA-NAG法等。其原理是：NAG催化底物发生分解，通过在不同时间测定底物或产物在特定波长下的吸光度来测定浓度变化，从而能判断催化酶NAG的浓度。CNP-NAG底物法使用的底物溶解缓慢且稳定性差，加热至于60℃6h才能完全溶解，溶解后4℃条件下只能存储7天，使用不方便；PNP-NAG法的分解产物与尿液颜色非常接，进而易对检测产生严重干扰；MNP-G1CNAc底物法的最大吸收峰在500nm，也易受尿液微黄色的干扰。目前，市场上现有产品的线性范围较窄，一般仅为(0，200]U/L，有待提高。总之，其它成分对光检测的干扰、试剂的不稳定性及试剂的老化问题是研发NAG紫外分光检测试剂的过程中，一直需要解决的问题。

近年来，VRA-NAG底物的研发和使用在一定程度改善了底物不稳定、减少了反应底物或产物对光检测的干扰。但检测过程中其它成分对检测造成干扰的问题仍有待改善，试剂的稳定性及检测的灵敏度需要进一步地提高，因此有必要进一步优化NAG的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、灵敏度高的NAG检测试剂及检测方法。

本发明提供了一种NAG检测试剂盒，其包括试剂R1；所述试剂R1包括：反应底物VRA-NAG、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、缓冲溶液、保护剂和增稳剂；其中，所述增稳剂包括氯化镁、EDTA、AES和HPD。

一些实施例中，不添加AES或HPD，其抗老化能力不如本发明提供的R1。

所述试剂R1中：所述缓冲溶液包括柠檬酸缓冲溶液，所述表面活性剂包括TritonX-100、Tween-20、PEG 6000中的一种或几种，所述保护剂包括蔗糖、海藻糖、葡萄糖中的一种或几种。

具体地，所述增稳剂包括：0.5～50mmol/L的氯化镁、0.5～50mmol/L的EDTA、0.1％～7.5％(V/V)的AES和0.1％～7.5％(V/V)的HPD。

具体地，所述试剂R1中：所述反应底物VRA-NAG的浓度为0.5～50mmol、所述抗坏血酸氧化酶的浓度为1～5KU/L、所述表面活性剂的浓度为0.02％～0.1％(V/V)、所述缓冲溶液为50～200mmol/L、所述缓冲溶液的pH为4.6-5.0、所述保护剂的浓度为0.5～25g/L。