[发明专利]一种纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种纳米晶体包裹CyHv‑2核酸亚单位疫苗的制备方法，重组病毒基因转染家蚕培养细胞，再培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒，再将重组病毒接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，通过收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，离心处理即可获得纳米晶体包裹的疫苗，为纳米晶体包裹CyHv‑2核酸亚单位疫苗；所述重组病毒基因含有CyHv‑2核酸序列以及部分多角体基因序列。现有技术公开的多角体CyHv‑2疫苗都为微米尺寸，本发明采用新的方法，得到纳米晶体包裹CyHv‑2核酸亚单位疫苗。

技术领域

本发明涉及病毒基因工程技术领域，具体涉及一种纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

异育银鲫鳃出血病由鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2）感染引起，一般认为免疫预防是鱼类病毒性疾病防治最有效的方法之一。现有技术CN2017101096414公开了基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，用该病毒接种家蚕或家蚕培养细胞，重组病毒表达的鲤疱疹病毒II型的抗原蛋白可包裹进家蚕质型多角体内，形成的多角体可以通过简单的差速离心实现纯化；纯化的多角体在碱性条件下裂解后，可以通过离心使多角体蛋白沉淀，而鲤疱疹病毒II型抗原留存在上清中，从而可以快速、方便地获得鲤疱疹病毒II型抗原；显微镜镜检可观察到感染发病的蚕的血淋巴中存在多角体，感染发病的蚕的血淋巴通过1000转/分和3000转/分的反复差速离心，可纯化到质型多角体，说明质型多角体蛋白基因已正确表达，多角体为2～3微米左右的蛋白微晶。现有技术CN 2021114991781公开了一种制备包裹外源蛋白的多角体的方法，通过基因工程方法利用杆状病毒表达系统在家蚕培养细胞或家蚕中共表达家蚕质型多角体蛋白、带有家蚕质型多角体病毒结构蛋白VP5标签以及蛋白酶特异性断裂位点的融合外源蛋白，从而形成包裹外源蛋白质的多角体，多角体为二十面体或八面体、大小为2～3µm左右的蛋白微晶，不仅对包裹的蛋白有防降解作用，而且有缓控释作用，因此包裹多肽药物的多角体可作为缓释药物开发。现有技术CN 2022100903243公开了一种基于多角体纳米结构的SARS冠状病毒-2疫苗及其制备方法和应用，通过对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）多角体基因进行选择，使其形成的多孔状蛋白晶体由微米结构改造成为纳米结构，与SARS-Cov-2刺突蛋白受体结合域（RBD）融合，插入杆状病毒穿梭载体中，通过转座构建重组杆状病毒，最终获得具有纳米晶体包裹的RBD肽段。可以看出，现有技术针对CyHV-2制备的杆状病毒表达系统多为微米级，因此需要研发纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗的制备方法，将多角体晶体结构作为基础材料，包埋固定外源蛋白；常规家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一种双链环状DNA病毒，基因组为128 kb左右，最外层包裹有多孔状的蛋白晶体，呈多面体，直径1～10微米，由晶状排列的碱溶性蛋白质组成，本发明制备的多角体晶体为纳米级，此晶体内部呈多空状、耐酸、耐强碱、耐高温和紫外线，由多角体包埋的外源蛋白在高温干燥的环境中依然有很高的稳定性，且能保持良好的生物学活性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤，将重组病毒基因转染家蚕培养细胞，再常规培养至细胞发病，然后收集细胞培养上清，获重组病毒，再将重组病毒接种家蚕幼虫或家蚕培养细胞，通过收集感染家蚕的血淋巴或家蚕培养细胞，离心处理即可获得纳米晶体包裹的疫苗，为纳米晶体包裹CyHv-2核酸亚单位疫苗；所述重组病毒基因含有CyHv-2核酸序列以及部分多角体基因序列。

本发明中，常规培养的培养温度为26～27℃。