[发明专利]一种稀有单细胞识别轮廓的可视化的方法

说明书

本发明属于液体活检领域，具体涉及一种稀有单细胞识别轮廓的可视化的方法，包括以下步骤：对循环肿瘤细胞进行特异性细胞膜染色；加入荧光增强试剂，所述荧光强度试剂为表面活性剂的有机相溶液，或有机醇；显微成像；将显微成像的照片转化成数字化照片，将所述数字化照片中的数字信号放大，得到可视化的细胞轮廓图。本发明采用表面活性剂或有机醇增强细胞表面的特异性荧光，从而提高了表面荧光信号的信噪比；利用数字信号放大技术，实现了单细胞特异性识别轮廓的可视化，避免了成像细胞的信号丢失；以荧光可视化的细胞轮廓为基础，可以实现捕获CTC计数和尺度估计的准确性。

技术领域

本发明属于液体活检领域，具体涉及一种稀有单细胞识别轮廓的可视化的方法，是一种基于细胞膜表面标志物识别荧光增强与数字信号放大相结合实现稀有单细胞识别轮廓可视化的方法。

背景技术

当实体肿瘤的组织细胞发生上皮-间充质转化而脱落时，肿瘤细胞将以单细胞状态进入静脉血液而发生体内循环，即循环肿瘤细胞(CTC)，它可以附着或者被拦截在远端器官内，即实现肿瘤转移。由于CTC伴随肿瘤发生和发展，且与发展成量效关系，因此，被认为是早期诊断的标记物，与临床诊断的金标准“组织活检”相提并论，也被称为液体活检。液体活检通常有3个基本步骤，(1)从静脉血中获得CTC，包括体外血液分离或者捕获CTC、和体内静脉血管中捕获CTC；(2)检测前的细胞预处理，如细胞固定、封蔽、膜打孔、荧光标记的识别配体(如抗体、适体)识别细胞膜标志物、核染色、以及离心、洗涤等，其中荧光标记的识别配体识别细胞膜标志物就实现了对捕获CTC膜的特异性染色，即“特异性膜染色”，这是判定捕获细胞为CTC的关键因素；(3)显微成像与镜检。为了保证镜检的准确性，预处理后的细胞成像，即照片中的荧光圆点，判定为CTC时，实验室和临床上通常要求同时满足3个条件，即有被DNA染料染色的细胞核、细胞核外可以观察到特异性膜染色、细胞尺度(通常10-60μm)明显大于血细胞(通常3-5μm)。后两者均依赖于细胞膜特异性染色的荧光强度。若荧光较弱，成像的CTC的特异性膜荧光不能被有效地观察，基于成像细胞的CTC计数就会偏少。同时，细胞尺度也不能较为准确地估计，其原因在于，显微镜检时细胞成像常常为一个荧光圆点或者圆圈，再根据成像标尺对荧光圆点的大小进行估计，即得细胞尺度，这就要求细胞成像圆点的荧光强度要足够大于眼睛的最低检测限，同时，整个细胞膜上大量分布的标志物要有足够量的被特异性识别，使成像圆点的荧光均匀分布，避免荧光圆点残缺、形状不规则，以保证成像的轮廓与CTC本身的细胞轮廓一致，才能基于完整的轮廓对细胞尺度进行较为准确的估计。因此，镜检时CTC计数和尺度估计的准确性均要求细胞成像需要具有“能够被可视化的、完整的细胞轮廓”，其根源就是，细胞膜特异性染色的荧光强度要足够的强，明显大于眼睛的最低检测限。

CTC计数的准确性是CTC检测作为癌症早期诊断依据的前提。由于CTC数量极其稀少，是典型的稀有细胞，中晚期患者检测的均值通常在10个以下，如肺癌5(Emilsson,V.,etal.Clin.Cancer Res.,2016,22:2197)、乳腺癌5.5(Nadia S.Z.,et al.Int.J.Oncol.,2012,41:1241)，且阳性阈值仅为1个CTC。如此低的阈值和极少的细胞数，极易因CTC的显微成像计数偏少，导致镜检不到CTC，使诊断为假阴性。因此，增强细胞膜特异性染色的荧光强度、以获得可视化的完整的细胞轮廓是CTC准确计数和尺度准确估计的关键。

利用CTC膜表面的大量分布的特异性表达蛋白作为识别受体，以荧光标记的特异性的识别配体(如抗体和适体)与CTC作用，可以在细胞膜表面通过形成“受体···配体-荧光体”复合物而使细胞膜特异性染色。理论上，显微镜下就可以观察到特异性染色的荧光圆点，圆点的轮廓应该就与CTC的实际轮廓一致，据此就可以基于特异性的荧光圆点进行CTC计数，根据圆点完整的轮廓就可以进行CTC尺度估计。现在的实验室和临床正是基于此实现了镜检下的CTC计数和尺度估计(Emilsson,V.,et al.Clin.Cancer Res.,2016,22:2197；Li R,et al.ACS Applied MaterialsInterfaces,2018,10:16327)。