[发明专利]一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法，包括：生物信息学查询与引物设计；高通量DNA提取方法工艺流程建立；引物初步筛选；KASP引物对筛选；KASP体系条件优化。本发明采用样品总基因组高通量提取工艺实验得到的改良CTAB法提取黄龙病检测样本48份，并且用进行国标法黄龙病普通PCR法检测样品的黄龙病感染阴阳性；将提取好的总基因组转移至384孔板中，每个样品转移4个孔；按照引物对采用C11a+B7a，引物比例和加入量以及优化后的扩增程序进行验证，得到的分型结果与国标普通PCR法比较，计算分型的准确度，所有实验数据真实、可靠，符合要求。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法。

背景技术

目前，柑橘是世界上生产量最大的水果之一，也是我国南方地区种植规模最大的水果种类之一，在农业经济中占非常重要的地位。而柑橘黄龙病(HLB)对柑橘的生产是有毁灭性的，该病害使柑橘树表现症状为叶片斑驳、叶片黄化、树势衰弱、红鼻子果或者是青果不转色等，还具有蔓延速度快、危害大的特点。一旦柑橘树感染该病，轻者会严重影响其果实产量与质量，重者则造成柑橘植株的枯死，造成我国大部分地区的柑橘产量下降，柑橘寿命短，生产成本增加，严重制约着我国乃至全世界柑橘产业的发展。目前针对HLB的检测方法检测过程繁琐、周期较长、检测费用高，对检测环境和操作要求高，且诊断准确率低，在实际生产中难以推广。因此，亟需设计一种新的柑橘黄龙病检测方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有HLB的检测过程繁琐、周期较长、检测费用高，对检测环境和操作要求高，且诊断准确率低。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法。

本发明是这样实现的，一种柑橘黄龙病高通量KASP检测方法，所述柑橘黄龙病高通量KASP检测方法采用内参引物和黄龙病检测引物共同检测的双引物法，信号值在靠近Y轴的群体为检测阴性，由Y轴向象限中部的靠近的群体为黄龙病阳性群体；所述柑橘黄龙病高通量KASP检测方法包括生物信息学查询与引物设计；高通量DNA提取方法工艺流程建立；引物初步筛选；KASP引物对筛选；KASP体系条件优化。

其中，所述黄龙病样品总基因组提取工艺改良CTAB提取法为按照0.1～0.2g研磨样品粉末加入1mL的CTAB裂解液在65℃中水浴1h后离心上清采取磁珠法提取，大量样品提取采用96孔深孔板结合高通量核酸提取仪完成。

所述内参引物选取柑橘扩增引物Forward：TTAGGAACAACAACAGGCACGA，Reverse：AGAAAATAATACCACAGTTCAGCCA；黄龙病检测引物扩增引物序列为Forward：GAACAACTTGAGTCTGTGGCGT，Reverse：GGTATTCGAGCTGGTATCATAAGTG；其中内参Forwardprimers合成过程添加HEX荧光接头序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；黄龙病Forward primers合成过程添加FAM荧光接头序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT。

所述优化后的黄龙病KASP检测体系Assy mix配制为：

黄龙病检测引物：FAM引物：下游引物：ddH₂O＝6μL：30μL：64μL；

内参检测引物：HEX引物：下游引物：ddH₂O＝12μL：30μL：58μL；

Assay mix配制为黄龙病检测引物：内参引物＝8：1，并按照1/35的比例加入2×MasterMix中。