[发明专利]一种具有宽底物谱的将羧酸专一转化为手性β-羟基羧酸的人工酶

说明书

本发明公开了一种将羧酸转化为β‑羟基羧酸的人工酶，属于蛋白质工程领域。本发明羧酸β‑羟基化酶P450_BSβ突变体是由野生型羧酸羟基化酶P450_BSβ的氨基酸序列在第78位、85位和290位突变得到的。羧酸β‑羟基化酶P450_BSβ‑L78I/Q85H/G290I是在脂肪酸β‑羟基化酶P450_BSβ‑L78A/Q85A/V170I/G290I的基础上改进后得到的产率更高、底物范围更广的人工酶。本发明构建的人工酶催化的底物范围扩展为C6‑C20链长的天然直链饱和脂肪酸、天然不饱和脂肪酸以及非天然羧酸。本发明可将这些底物一步转化为相应的(R)‑β‑羟基羧酸。

技术领域

本发明涉及一种利用过氧化氢作为氧化剂将羧酸转化为β-羟基羧酸的人工酶，属于蛋白质工程领域。

背景技术

β-羟基羧酸是一类重要的化合物。含有10-14个碳原子的β-羟基羧酸(C10-C14)具有天然的除草和抗真菌特性。当与氨基酸或碳水化合物结合时，它们可以创造出更多具有结构复杂性和生物学意义的天然产物，如抗生素、具有杀虫效果和免疫调节活性的有机化合物。β-羟基羧酸还可以作为合成二醇、β-氨基酸、β-内酯、β-内酰胺、双环庚酮和多羟基烷酸酯的合成前体，它们在天然产物合成、药物发现和生物材料中有着更多的应用。因此，β-羟基羧酸的制备受到了广泛的关注。

常用的合成β-羟基羧酸的化学方法包括线性醛的不对称aldol反应，Reformatsky反应和β-酮基羧酸的不对称氢化反应，通常需要过渡金属和复杂的催化配体或化学计量的手性助剂。酮还原酶还可以不对称地还原β-酮基羧酸，提供酶促途径获得手性β-羟基羧酸。

在前期的研究中，通过工程化P450_BSβ变体(P450_BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I)对生物可用脂肪酸进行β-C-H氧化官能化。尽管这是一种直接、分步经济且生态友好的反应，具有优异的区域选择性和对映选择性，但可接受的底物仅限于链长超过10个碳原子的脂肪酸，妨碍其在β-羧酸合成中的广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的技术缺陷，提供一种利用过氧化氢作为氧化剂将羧酸转化为β-羟基羧酸的人工酶，制备的羧酸β-羟基酶P450_BSβ突变体催化产生β-羟基羧酸，将底物范围扩大至C₆-C₂₀链长的天然直链饱和脂肪酸、油酸、亚油酸以及带有不同官能团的非天然羧酸。该发明具有反应活性高、高区域和对映体选择性、底物范围广、体系简单、合成效率高和成本低廉等优势。

本发明通过对P450_BSβ羟基化酶的定向进化实现了对羧酸的未活化β位C-H键的高度区域和对映选择性地氧化。获得的P450_BSβ羟基化酶突变体能够直接使用廉价的过氧化氢作为氧化剂，以C6-C20链长的天然直链饱和脂肪酸、天然不饱和脂肪酸(油酸或亚油酸)以及含有烯烃、炔烃、溴、胺、腈、酯、二羟基、环戊基、呋喃、吡咯、苯甲氧基(邻位、间位、对位)、氟苯基、氯苯基、苯甲酰甲氧基等不同官能团的非天然羧酸为底物生成R型手性的β-羟基羧酸。

为解决上述技术问题，本发明提供一种羧酸β-羟基化酶P450_BSβ突变体，含有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述羧酸β-羟基化酶P450_BSβ突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含上述羧酸β-羟基化酶P450_BSβ突变体的核苷酸序列的载体。

本发明还提供表达上述羧酸β-羟基化酶P450_BSβ突变体的基因工程菌。