[发明专利]miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用

权利要求书

1.miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，其特征在于：具体包括miRNAs对CART抑制作用的比较分析和miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控；

所述miRNAs对CART抑制作用的比较分析，具体包括以下步骤：

步骤一：脂质体转染法转染293T细胞；

步骤二：qRT-PCR检测293T细胞基因表达，具体包括：细胞总RNA提取及检测；mRNA反转录；miRNA反转录；引物设计；荧光定量PCR检测；

步骤三：Westernblot检测293T细胞CART蛋白表达，具体包括：细胞总蛋白提取；BCA法蛋白浓度测定；聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制；上样；电泳；转膜；封闭；一抗、二抗孵育；显影；

所述miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控，具体包括以下步骤：

步骤一：小鼠侧脑室注射；

步骤二：qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达；

步骤三：Westernblot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达；

步骤四：Elisa检测小鼠血清CART浓度。

2.如权利要求1所述的miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，其特征在于：

所述脂质体转染法转染293T细胞，具体包括：

①设置7个试验组：miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-493+CART组、miR-758+CART组、miR-877+CART组和miR-381+CART组；1个阳性对照组：NC+CART组；8个阴性对照组：miR-377+pEX-3组、miR-331-3p+pEX-3组、miR-491+pEX-3组、miR-493+pEX-3组、miR-758+pEX-3组、miR-877+pEX-3组、miR-381+pEX-3组和NC+pEX-3组；1个转染试剂对照组：TransIntroTM EL组；1个空白细胞组：空白组；上述每组三个重复；

②bta-miRNAs mimics与NC片段合成；

③将4μg质粒DNA/pEX-3与250pmolmiRNA/NC加入到200μL DMEM basic(1×)培养基中轻柔混匀，室温放置5min；将12μL TransIntroTM EL加入到200μLDMEMbasic(1×)培养基轻柔混匀，室温放置5min；将稀释后的TransIntroTM EL加入到稀释后的质粒DNA与miRNA的混合液中轻柔混匀，室温放置15～20min；

④铺板后培养12～24h，待细胞达到70～80％汇合度时，弃去旧培养液，用适量PBS清洗细胞2次；每孔加入2mLRPMIMedium 1640basic(1×)，再加入各组的转染混合物后置于37℃，5％CO₂恒温培养箱静置培养；4～6h后弃去转染液更换为完全培养液，继续培养24～48h。