[发明专利]冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法

说明书

本发明提供了用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，本发明还提供了利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，用于单囊胚移植当中，从而本发明还提供了相应的单囊胚移植方法和系统。

技术领域

本发明属于辅助生殖技术领域。具体地，本发明涉及一种在体外受精-胚胎移植技术中应用于胚胎冷冻/复苏的一系列方法，包括用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，还包括利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，以及相应的单囊胚移植方法和系统。

背景技术

体外受精-胚胎转移技术(IVF-ET)是怀孕困难夫妻孕育后代的最终解决方案之一。迄今为止，全球已有超过800万的婴儿是借助IVF-ET技术出生。在此过程中，由于胚胎移植时，一般会尝试多胚胎移植，使得多胎妊娠率居高不下，目前已达到20％。多胎妊娠会增加不良妊娠结局并危及母婴健康，选择性单囊胚移植(eSET)是降低多胎妊娠率的最有效方法，在国际上得到越来越多的应用。在这样的趋势下，提高单胚胎移植的成功率至关重要，但目前仍然欠缺科学的胚胎发育潜能的评价方法。

染色体非整倍体会导致胚胎发育停滞或胚胎着床失败，是导致IVF妊娠率低下、流产率较高的一个重要因素。在流产胎儿中，非整倍体占比达50％以上。现阶段最常用的胚胎选择方法是传统的形态学评估，但其无法单独识别胚胎的染色体情况。因此，可以对于染色体非整倍体的高风险人群实施胚胎植入前遗传学非整倍体检测技术(preimplantationgenetic testing for aneuploidy，PGT-A)，在植入前对胚胎染色体进行拷贝数分析。但如果待孕者未能在首个周期选择PGT-A，若发生种植失败或流产，只能继续通过形态学评级对剩余的冻存胚胎进行选择，无法确认染色体情况。

如果这部分人群在移植失败或流产后，计划选择PGT-A检测，则需要在经历胚胎复苏后，再实施有创的胚胎活检和二次冷冻等一系列操作，可能使胚胎受损。因此，针对此类人群，若能通过无创染色体筛查，检测胚胎的染色体倍性，可在复苏后避免胚胎的活检操作，极大的减少胚胎受损的可能。

胚胎在培养过程中会释放cfDNA到培养液中，近些年，通过cfDNA进行无创PGT-A检测成为辅助生殖领域的研究热点。特别是对冷冻后复苏胚胎的培养液进行的相关研究表明，与新鲜胚胎培养液相比，冻胚培养液被证明更适合实施无创胚胎植入前遗传学非整倍体检测(niPGT)。研究通常在冻胚复苏后，培养14-24h，收集培养液或者囊胚腔液和培养液混合液，样本扩增成功率为92.3-100％，以整胚的结果为金标准，对比培养液结果与整胚结果的一致性，准确性可达 87-100％。Kuznyetsov等人的研究结果显示，NICS结果与整胚结果的一致性甚至超过TE结果与整胚结果的一致性(96.4％vs 87.5％)。但是，通常在冷冻复苏周期中，以上研究的冻胚复苏培养时间均较长(14-24h)，这对于已经达到冷冻标准的冻存囊胚来说，体外培养时间过长，则错过胚胎种植的最佳时机，并不适合在实际临床工作中应用。

目前，临床上常规地会在胚胎发育的第5至第7天(囊胚阶段)，对胚胎进行形态学评级，选择级别为3BC以上的囊胚进行冷冻，并在冷冻前进行激光皱缩。胚胎冷冻多采用玻璃化冷冻技术，临床使用较多的载体是cryoleaf、cryotop、冷冻环cryoloop。冷冻液和解冻液均购买商业化产品，如日本加藤公司。囊胚冷冻的过程是：平衡和洗涤囊胚，然后装管并装载，投入液氮冷冻。在复苏时，把囊胚进行平衡、洗涤和培养。囊胚在复苏2小时后囊胚腔扩张，则表明复苏成功。大部分中心培养2-3小时后直接移植囊胚。个别中心会过夜培养(18-20h)，再把胚胎移植到患者体内。个别中心会对胚胎活检，再次冷冻胚胎，待活检结果出来后，复苏整倍体的胚胎进行移植。

本发明提供了一种改进的胚胎复苏培养方式，对冷冻囊胚进行检测、培养和评估。

发明简述