[发明专利]一种聚合酶突变体及其应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种ZO5 DNA聚合酶突变体及其应用。具体技术方案为：一种ZO5 DNA聚合酶突变体，在ZO5野生型聚合酶基础上突变获得，所述ZO5野生型聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；突变位点包括：E628K、I709L、E744R、A745R。本发明提供的聚合酶突变体可以扩大其包括逆转录酶在内的多种活性的能力，可以使用RNA模板催化逆转录环介导的等温扩增。融合结合肽后的聚合酶突变体，具有很强的抗干扰能力，例如巧克力、花生酱、牛奶、海鲜、肉或蛋，巧克力、胡椒、血液、尿液、腐植酸、胆汁、单宁、黑色素、靛蓝染料、植物材料等的干扰；并可有效缩短LAMP所需时间。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种聚合酶突变体及其应用。

背景技术

Taq聚合酶和Bst聚合酶是两种众所周知的耐热DNA聚合酶，两者的晶体结构有50%的序列同源性。Taq聚合酶可以催化PCR（该反应要求酶必须耐受94℃），但Bst聚合酶的活性为65～70℃，因此不能催化PCR。同时，Taq聚合酶不能通过置换其前面的DNA链来复制双链DNA，且Taq聚合酶的5'-核酸内切酶会降解置换的DNA；但Bst聚合酶可以有效地进行链置换而不降解，因此通常用于催化环介导的等温扩增（LAMP）。但Taq聚合酶和Bst聚合酶都没有逆转录酶（RT）活性,因此通常需要将单独的RT酶与之结合以完成RT-PCR（逆转录酶聚合酶链反应）或类似的RT-LAMP。

与之相对的，ZO5 DNA聚合酶具有很强的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）活性,但不能通过链置换使DNA链复制双链DNA,因此不能用于催化环介导的等温扩增（LAMP）或者RT-LAMP。

为了通过PCR或者类似的LAMP扩增RNA目标，有必要先将RNA模板逆转录成cDNA。在RT-PCR或者类似的RT-LAMP中，混合酶由于各自的反应最佳条件不同而很难发挥各自的优势。通常，RT-PCR测定依赖于源自嗜常温生物体、用于初始cDNA合成步骤（RT）的非热稳定的逆转录酶（RNA依赖性DNA聚合酶）。在PCR中，需要额外的热稳定DNA聚合酶用于扩增cDNA，以耐受对于核酸变性所需的温度升高。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA聚合酶突变体及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种ZO5 DNA聚合酶突变体，在ZO5野生型聚合酶基础上突变获得，所述ZO5野生型聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；突变位点包括：E628K、I709L、E744R、A745R。

优选的，突变位点还包括：E710K、E710L、E710N、E710Q、E710I、E710W、E710R、E710V、E710S中任意一项的突变。

优选的，所述聚合酶突变体对所述野生型聚合酶进行截短后获得。

优选的，在所述野生型聚合酶的第282位进行截短。

优选的，所述聚合酶突变体中融合了结合肽。

优选的，所述结合肽选择Sso 7d、Tm Csp、Sac 7d中的任意一种。

相应的，一种聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

相应的，一种聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

相应的，所述聚合酶突变体在PCR、RT-PCR、LAMP、RT-LMAP中的应用。

相应的，包含所述聚合酶突变体的试剂、试纸、试剂盒。

本发明具有以下有益效果：使用工程改造的热活性或热稳定DNA聚合酶以进行更有效的逆转录用于RT-PCR或者类似的RT-LAMP测定具有几个潜在的益处：