[发明专利]母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用

说明书

本发明公开了母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用，母乳细胞外囊泡的制备包括以下步骤：收集人的新鲜母乳，离心去除脂肪，取上清；然后离心去除细胞和碎片，取上清；再用过滤膜过滤，将所得上清液离心收集沉淀，加入溶剂重悬沉淀；再离心去除溶剂，加入少量溶剂重悬沉淀；最后用过滤膜过滤即得到母乳细胞外囊泡。母乳细胞外囊泡可被间充质骨髓干细胞摄取，提高间充质骨髓干细胞Runx2，Alp和Bmp2蛋白的转录水平，促进间充质骨髓干细胞向成骨细胞分化。将母乳细胞外囊泡装载至骨组织工程支架材料上，可显著促进骨再生。

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用。

背景技术

骨移植是骨科手术中最常用的促进骨再生的手术方法之一。在所有临床可用的骨移植中，自体骨仍被认为是金标准，因为骨再生所需的所有必要特性，骨传导、骨诱导和骨生成都被结合起来。然而，供应有限和供体并发症的担忧仍然存在。因为同种异体骨移植形式多样，数量众多，同种异体骨移植在骨科移植中占主导地位。然而，与使用自体移植物相比，同种异体骨移植会导致较差的愈合，也有疾病传播和其他感染因子传播的可能。更重要的是，传统上可用的天然骨移植数量仍然远远不能满足临床需求。

为了解决这些局限性，合成骨替代品成为骨科行业最具潜力的市场之一。其中，以磷酸钙(CaP)为基础的生物材料(如羟基磷灰石(Hap)、CaP水泥和陶瓷)和重组人骨形态蛋白(rhbmp，如rhBMP-2和rhBMP-7)应用最为广泛，无论是单独使用还是联合使用。原来的骨替代品一般仅具有骨导电性，主要应用于大骨缺损的重建，而重组人骨形态蛋白基本具有骨诱导作用，具有促进骨折愈合的能力。然而，重组人骨形态蛋白在临床应用中因其超生理剂量、不良临床结果和成本问题而受到了广泛关注。因此，迫切需要研究开发更多的药物或生物材料，为促进骨再生提供更多有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供母乳细胞外囊泡及其在制备骨修复材料中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种母乳细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

收集人的新鲜母乳，离心力500～5000×g(优选2000×g)，离心5～30min去除脂肪，取上清；然后10000～16000×g(优选12000×g)，离心15～45min(优选30min)去除细胞和碎片，取上清；再用过滤膜过滤，将所得上清液100000～160000×g(优选12000×g)离心2～24h(优选2h)，收集沉淀，加入溶剂重悬沉淀；再以100000～160000×g(优选12000×g)超离2～24h(优选2h)，去除溶剂，加入少量溶剂重悬沉淀；最后用过滤膜过滤即得到母乳细胞外囊泡；

上述操作均在4℃的环境中进行；

所述溶剂是与母乳细胞外囊泡具有生物相容性的溶剂，为缓冲液或液体培养基；

所述的缓冲液优选PBS缓冲液，pH值为6.5～7.5，pH值优选7；

所述液体培养基选自DMEM液体培养基、MEM液体培养基、RPMI 1640液体培养基、F12液体培养基或IMDM液体培养基中的一种或几种；

所述过滤膜(针头除菌过滤器的滤头)为0.1～1μm的微孔除菌过滤膜，优选0.22μm的微孔除菌过滤膜。

由上述方法制得的母乳细胞外囊泡，尺寸为30～1000nm，蛋白浓度为0.01～1000μg/mL，颗粒数为1×10⁸～1×10¹³/mL；

当尺寸过小(小于30nm)时，现有的离心条件满足不了；当尺寸过大(大于1000nm)时，所提取的可能为细胞碎片，而不是细胞外囊泡；

优选地，蛋白浓度为0.1～100μg/mL；更优选地，蛋白浓度为1～50μg/mL；更进一步优选地，蛋白浓度为25μg/mL；