[发明专利]外泌体分离纯化方法在审
| 申请号： | 202210500290.0 | 申请日： | 2022-05-10 |
| 公开（公告）号： | CN114591892A | 公开（公告）日： | 2022-06-07 |
| 发明（设计）人： | 葛啸虎;王淼;陆路;田应洲;陈巍;杜焕青;韩春乐;王飞;温智钧;高梦雅;王帅 | 申请（专利权）人： | 天九再生医学（天津）科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 天津诺德知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 12213 | 代理人： | 栾志超 |
| 地址： | 300457 天津市*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 外泌体 分离 纯化 方法 | ||
1.外泌体分离纯化方法，其特征在于：取含有外泌体的体液或培养液，先3000g-8000g离心，离心后取上清和/或过滤器除蛋白的方法去除沉淀蛋白；
然后通过深层滤器进行深层过滤去除脂肪球；
再经阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析，获得的流穿液为纯化后的外泌体溶液。
2.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：进行阴离子交换层析、阳离子交换层析和/或分子筛层析前预先进行超滤。
3.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述阴离子交换层析填料的配基为强阴离子交换配基或弱阴离子交换配基。
4.根据权利要求3所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：阴离子交换配基为季铵基、二乙氨基乙基、二乙氨基丙基中的一种或几种的组合，填料粒径范围为15-300μm，孔径范围为20-150nm，阴离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为7.0-7.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。
5.根据权利要求1所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述阳离子交换层析填料的配基为强阳离子交换配基或弱阳离子交换配基，阳离子交换层析过程中平衡缓冲液pH为8.0-8.4，缓冲液电导率不高于10ms/cm。
6.根据权利要求5所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：阳离子交换配基为磺酸基丙基或羧甲基的一种或两种的组合，填料粒径范围为15-300μm，孔径范围为20-150nm。
7.根据权利要求1-6中任一所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：含有外泌体的体液为乳源样品时，预先对样品进行杂质去除处理；
杂质去除处理为酸沉淀、凝乳酶处理和盐析处理中的一种或多种的组合。
8.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：所述杂质去除处理为去除杂质蛋白和/或脂肪球，其中杂质蛋白为酪蛋白及其他等电点为pH4.0-5.5的杂蛋白。
9.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：
一级纯化：对乳源样品进行杂质去除处理，去除杂质后得到外泌体粗提液；
二级纯化：实施方式一、方式二和方式三的纯化步骤，其中方式一、方式二和方式三能够按照任意顺序进行排布，方式一、方式二和方式三均至少包括一次；
方式一：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体粗提液进行阴离子交换层析进行纯化，取流穿液；
方式二：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体溶液进行阳离子交换层析进行纯化，取流穿液；
方式三：将上一步骤纯化所得溶液通过超滤膜包或中空纤维柱进行超滤浓缩换液；对浓缩后的外泌体溶液进行分子筛层析进行纯化，取外水峰范围流穿液；
最终获得的外泌体纯化溶液即为纯化后的外泌体溶液。
10.根据权利要求7所述的外泌体分离纯化方法，其特征在于：乳源样品为生乳样品、脱脂乳样品或巴氏消毒乳样品。
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