[发明专利]一种强抗干扰且稳定的AFU检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，提供了一种强抗干扰且稳定的AFU检测试剂盒，包括：缓冲液50～300mmol/L，表面活性剂0.01～0.2％，防腐剂0.05～0.3％，稳定剂0.3～1.0％，抗干扰物质0.75～2％，底物1～3mM；其中，所述稳定剂为L‑半胱氨酸、组氨酸中的一种，所述抗干扰物质为α‑环糊精、β‑环糊精、γ‑环糊精、改性环糊精中的一种。本发明还提供了一种强抗干扰且稳定的AFU检测试剂盒的制备方法。本发明的优点在于：热稳定性强，抗肝素干扰能力强，且操作简便、快速、准确，适用于临床应用。

技术领域

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，尤其涉及一种强抗干扰且稳定的AFU检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

α-L岩藻糖苷酶(α-L-Fucosidase，AFU)，是一种溶酶体酸性水解酶，分类名为α-L-岩藻糖苷酶岩藻糖水解酶(EC32.1.51)，主要分布于人体内的各种组织、细胞和体液中，在肝、肾等组织中活性较高。AFU能够水解含有岩藻糖的脂质、粘蛋白和粘多糖，而AFU检测试剂正是利用这一特性对其活力进行检测。多项研究证实AFU是一项诊断原发性肝癌的新型肿瘤标志物。

原发性肝癌(PHC)患者血清中AFU活性不仅显著高于正常人群，而且显著高于转移性肝癌、胆管细胞癌、恶性间皮瘤、恶性血管内皮细胞瘤、肝硬化、先天性肝囊肿和其他良性肝占位性病变患者。一般认为：AFU的敏感性高于甲胎蛋白(AFP)，特异性则差于AFP。AFU与AFP无明显相关，二者联合监测可提高肝癌的检出率，特别是对AFP阴性和小细胞肝癌的诊断价值更大。

PHC患者的血清AFU持续升高且幅度较大，这一特性更有助于鉴别诊断。同时血清AFU还可以做为PHC术后监测、追踪观察的较理想指标，其变化与病情程度相关联，且早于临床症状1～2个月，故可做为PHC疗效和预后判断指标。

目前，测定AFU活力的方法主要有荧光法、终点比色法、速率法。其中，荧光法是利用岩藻糖苷化合物在岩藻糖苷酶水解后，释放出可发射荧光的4-甲基伞型酮，通过检查荧光强度来分析酶活力；该方法的灵敏度高，既能用于血清，也适用于活检组织、细胞、脑脊液等量小的样本；但是该方法对仪器要求高，不仅需要凝胶过滤除去干扰物质，而且需要荧光分光光度计，不能用于自动化分析，难以进行普及推广。终点比色法是以PNP-AFU为底物，底物被酶分解后产生色团，该色团在碱性条件下呈现黄色，利用分光光度法进行定量分析；本方法简便、设备要求不高，但是由于酶底物本身的抗干扰性差，不能解决血清黄疸和溶血、脂血等因素对测定结果的影响，且操作繁琐，所需反应时间长；而且AFU作为酶需要在酸性环境下进行酶促反应，而色团需在碱性条件下呈色，所以也不适合自动化检测，推广难度大。速率法是以AFU在适宜反应条件下催化含呈色基团的特定底物水解，在一定波长下可使吸光度增加，连续监测吸光度值的变化，可计算出样本中AFU的活性，操作简单，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都有所提高，适用于各种半/全自动分析仪器，便于临床单位推广应用。

AFU速率法试剂盒中的底物为2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷(CNPF)，检测原理是样本中的α-L-岩藻糖苷酶(AFU)催化底物(CNPF)反应生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，该物质呈黄色，在405nm处有吸收峰，因此可通过吸光度测定其发色量来定量检测样本中AFU的浓度。然而，目前市面上底物CNPF普遍存在热稳定性差的问题，底物在水溶液中高温下会加速其自发氧化水解而自然发色，从而导致检测结果不准确。其次，有研究表明肝素对AFU检测呈现正基质效应，原因是肝素有类α-L岩藻糖苷酶作用，能使底物CNPF分解，从而使检测结果假性升高。因此，亟需一种稳定并且抗肝素干扰的α-L-岩藻糖苷酶速率法检测试剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种热稳定性强，抗肝素干扰能力强，且操作简便、快速、准确，适用于临床应用的AFU检测试剂盒及其制备方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：