[发明专利]靶向胶原蛋白的血栓抑制剂及其制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向胶原蛋白的血栓抑制剂及其制备方法。本发明基于之前设计的七肽LWWNSYY，并针对其疏水性优化得到新多肽LEKNSTY，在其基础上又优化其血清稳定性得到LekNStY和lEKnsTy。优化后的LEKNSTY水溶性良好，进一步优化的LekNStY和lEKnsTy不仅水溶性良好，且血清稳定性得到了极大提高，优化后的肽抑制剂LEKNSTY，LekNStY和lEKnsTy与胶原蛋白的结合能力较强。分子动力学模拟、自由能分析和等温滴定量热实验都证明了强结合，并发现疏水作用为主要驱动力，优化后的三个肽抑制剂抑制血小板粘附的能力得到证实，其中lEKnsTy抑制能力最强。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向胶原蛋白的血栓抑制剂及其制备方法。

背景技术

病理性动脉血栓形成是心血管疾病的重要原因。血小板表面整合素α2β1与血管内壁暴露的胶原蛋白结合被认为是血小板在受损血管壁表面吸附的关键，这是动脉血栓形成的重要步骤。而目前市面上大多数抗血栓药物是抗血小板药物，但抗血小板药物会给患者带来如出血和血小板减少等副作用，因此，靶向胶原蛋白治疗动脉血栓成为新思路。

在之前的工作中，研究者也设计了一种靶向胶原蛋白的抗血栓肽LWWNSYY，以抑制血小板整合素α2β1在胶原蛋白表面的结合。LWWNSYY被证实能有效抑制血栓形成，但由于它在生理盐水或血液中的水溶性较差，限制了其抑制血栓的应用。研究者也曾将LWWNSYY固定在纳米颗粒的表面，将获得的纳米缀合物开发为高效抗血栓纳米药物。然而，考虑到合成复杂和成本增加，它还远远不够，因此，基于LWWNSYY，我们又提出了通过重新设计肽的氨基酸序列来改善水溶性。

但是后来又由于改善序列后的多肽在血清中稳定性较弱，易被酶切降解，因此在上述优化的基础上继续优化。早期研究发现，天然的蛋白质受体和蛋白酶对镜像结构具有高度专一性，例如，D-或L-HIV-1蛋白酶仅切割相应的对映体底物。由于人体内大部分蛋白酶是L-蛋白酶，这使得D-蛋白质或多肽在体内可以抵抗L-蛋白酶的水解。因此，引入D-氨基酸对酶促切割敏感处的氨基酸进行替代是避免酶解，延长血浆半衰期的一种有效策略。因此现有技术的缺点为改善序列后的多肽在血清中稳定性较弱，易被酶切降解。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供靶向胶原蛋白的血栓抑制剂及其制备方法，本发明提供本发明的目的是在于开发新型的亲水性且在血清中稳定存在的抗血栓多肽抑制剂。本发明所述的多肽抑制剂是首次提出的，其设计和验证流程是有效的。所述的多肽抑制剂水溶性和血清稳定性得到提高，且结合性能良好并具备抑制效果。

本发明提供了氨基酸序列为LEKNSTY的七肽，其中任意位置的氨基酸为L型或D型。

本发明基于之前设计的七肽LWWNSYY并针对其疏水性进行优化得到新的七肽LEKNSTY，在LEKNSTY的基础上又优化其血清稳定性得到新的七肽LekNStY和lEKnsTy。本发明通过荧光分光光度计证明其具有良好的亲水性，通过反相色谱证明该七肽具有良好的血清稳定性，通过分子动力学模拟和等温滴定量热仪证明了该七肽具有良好的胶原蛋白的结合能力，通过紫外分光光度计和酶标仪验证了对本发明所述其他对血小板聚集存在抑制能力。

本发明所述的七肽，其为LEKNSTY、LekNStY或lEKnsTy；其中大写字母代表L型氨基酸，小写字母代表D型氨基酸。

即本发明所述的七肽的N端至C端依次为：

L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-酪氨酸；

或为L-亮氨酸、D-谷氨酸、D-赖氨酸、L-天冬酰胺、L-丝氨酸、D-苏氨酸和L-酪氨酸；

或为D-亮氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、D-天冬酰胺、D-丝氨酸、L-苏氨酸和D-酪氨酸。