[发明专利]一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法及其应用

说明书

本发明公开了一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，将Cas9 mRNA和靶序列gRNA混合后，在翘嘴鳜卵受精后的45分钟内，利用显微注射的方式对1细胞期受精卵动物极进行注射。本发明还公开了上述编辑方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用，利用本发明得到的amhy基因突变F0代雄鱼进行传代得到的F1代中含有移码突变的雄鱼个体会发育为雌性。本发明第一次建立翘嘴鳜胚胎显微注射操作技术，并首次实现翘嘴鳜内源性基因的编辑操作，为开展翘嘴鳜基因功能研究及翘嘴鳜养殖品种的遗传改良提供强有力的技术手段。

技术领域

本发明属于鱼类分子育种技术领域，具体涉及一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法及其应用。

背景技术

翘嘴鳜（Sinipercachuatsi），属于鲈形目（Perciformes），鳜科（Sinipercidae），鳜属（Siniperca），在我国食用史极其悠久，在公元前2200年的《山海经》中即有“洛水多滕鱼，状如鳜”的记载。一直以来，翘嘴鳜凭借其肉质鲜美，营养丰富且无肌间刺的优点深受消费者喜爱。近年来，鳜鱼的水产养殖产量逐年攀升，根据2020年中国渔业统计年鉴，其水产养殖产量为37.6986万吨，具有巨大的经济价值，其中翘嘴鳜为主要养殖品种。值得注意的是翘嘴鳜的生长具有两性异形的特征，即同龄商品规格的翘嘴鳜，雌鱼的体重超过雄鱼约10-20%，因此实现翘嘴鳜全雌养殖具有更高的经济效益。

近年来，利用传统育种手段，翘嘴鳜取得较多成果，并获批了多个国家审定的新品种，包括翘嘴鳜华康1号，秋浦杂交鳜，长珠杂交鳜，以及2020年最新获批的翘嘴鳜广清1号和全雌翘嘴鳜鼎鳜1号。然而，翘嘴鳜的基因功能和遗传改良育种等方面研究却进展缓慢，一直受制于有效研究技术的缺乏。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来发展起来基因组定向编辑和改造技术，主要是利用靶向特异的guide RNA，引导Cas9蛋白酶对靶向DNA序列完成特异性切割。该技术操作简单，对基因组切割效率高，目前已在多种鱼类中得到应用，包括斑马鱼、青鳉、黄颡鱼、半滑舌鳎、尼罗罗非鱼、斑点叉尾鮰、白斑狗鱼、虹鳟、鲤鱼、黄鳝等。但是，迄今为止，尚无在鳜鱼中实现基因编辑操作的报道。

因此，建立翘嘴鳜的基因编辑技术，既可以用于验证翘嘴鳜基因的功能，解读翘嘴鳜的性别决定及雌雄差异生长机制，又可以用于探索研制翘嘴鳜养殖新品系，为翘嘴鳜养殖提供遗传改良的新品种。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，通过体外转录合成靶基因的gRNA和Cas9蛋白的mRNA，将两者混合，然后采用显微注射的方式将混合物导入翘嘴鳜1细胞期的受精卵的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的翘嘴鳜。

本发明的第二目的在于提供上述方法在翘嘴鳜XY型生理雌鱼育种方面的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种翘嘴鳜CRISPR/Cas9基因编辑方法，将靶基因gRNA与Cas9 mRNA混合后，通过显微注射的方式注射到授精时间不超过45分钟的1细胞期受精卵的动物极中。

优选的，所述靶基因gRNA的终浓度为100~300 ng/µL，更佳为100ng/µL。

优选的，所述Cas9 mRNA的终浓度为300~600 ng/µL，更佳为500 ng/µL。

优选的，每颗受精卵的注射体积为2~5 nL，更佳为2 nL。

优选的，合成所述靶基因gRNA的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，采用T7 Endonuclease I酶切法和Sanger测序法对注射后受精卵的靶基因突变进行检测。