[发明专利]水稻三磷酸肌醇激酶基因的应用

说明书

本发明公开了水稻NAC转录因子基因在种子活力改良中的应用。所述的基因OsITPK4核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及编码相应的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明在水稻中首次报道了OsITPK4基因能调控水稻种子活力，通过试验表明突变该基因后，种子活力显著降低，过量表达该基因提高种子活力。证明本发明OsITPK4基因调控了水稻种子活力，利用该基因有助于筛选和培育高活力水稻品种，有利于直播稻生产。

技术领域

本发明属于种子生物技术领域，涉及一个1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因OsITPK4的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一。水稻直播栽培方式具有省工、省力，节约成本、经济效益好等优势，近年来生产面积逐年扩大。但直播稻存在难全苗、草害重、易倒伏等难题。高活力种子在田间具有发芽好、成苗快，幼苗生长潜势大、抗逆能力强等特性，这对保障直播稻产量具有重要作用。1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶(ITPK)是一种保守的多功能酶，在调控磷酸肌醇代谢,生物信号传导及生长发育中起重要作用，广泛参与植酸生物合成、植物抗逆等多种生物学过程。但其在调控水稻种子活力中的功能尚未报道，有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的是提供一个调控水稻种子活力的1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶OsITPK4分离克隆、功能验证和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的一个来自水稻的1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶OsITPK4，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶OsITPK4，其氨基酸序列SEQ IDNO.2所示。

本发明所述的水稻OsITPK4基因或蛋白在筛选或培育高活力水稻品种中的应用。

所述的水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶OsITPK4在提高水稻种子活力，促进直播稻生产中的应用。

所述的应用优选，过表达OsITPK4基因以提高水稻种子活力。

本发明所述的水稻OsITPK4基因突变体获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻OsITPK4基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)设计靶位点及其引物，以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增，纯化回收PCR产物，获得MT1T2-PCR载体；

(3)将步骤(2)得到的带有OsITPK4基因的目标片段的MT1T2-PCR胶回收产物构建到pHUE411载体上，获得pHUE411+MT1T2-PCR载体；

(4)将步骤(3)得到的带有OsITPK4基因目标片段的质粒转化农杆菌；将带有转化质粒的农杆菌转化水稻；

(5)水稻突变体筛选与鉴定，并进行发芽表型鉴定。

进一步的，在步骤(1)中利用水稻cDNA为模板，PCR克隆出该基因的序列，所述PCR的上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步的，在步骤(2)中构建的水稻OsITPK4 CRISPR/Cas9突变体gRNA靶序列(OsITPK4基因中19bp的目标片段)如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6(两个靶点)；以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增的引物序列如序列表SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10；

在步骤(3)中，用BsaI酶切pHUE411载体，利用同源重组法获得pHUE411+MT1T2-PCR载体。