[发明专利]一种以葡萄糖为底物一步发酵合成2-酮基-L-古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种以葡萄糖为底物一步发酵合成2‑酮基‑L‑古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在氧化葡萄糖酸杆菌ATCC9937中敲除醛酮还原酶bdhAB，异源表达2,5‑DKG转运蛋白KgtpA、2,5‑DKG还原酶dkgA，获得能够通过葡萄糖直接合成2‑KLG的重组氧化葡萄糖酸杆菌ZL01‑ΔbdhAB‑dkgA‑KgtpA，该菌株能够以葡萄糖为底物一步发酵合成2‑KLG，对于在化妆品、纺织品、食品等领域实现2‑酮基‑L‑古龙酸或维生素C的工业化生产具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种以葡萄糖为底物一步发酵合成2-酮基-L-古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

维生素C又称L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，具有很强的还原性,是人体必须的维生素之一。全球每年维生素C需求量在13-15万吨左右，其中，中国每年出口13万吨，约占世界产能的80％以上。我国每年的维生素C产量为20万吨左右，高于全球需求量，导致维生素C行业面临着严重的产能过剩问题。因此，如何进一步降低维生素C生产成本对于维生素生产企业至关重要，同时随着维生素C其他功能不断被发掘，其后期需求量势必会进一步增加，因此作为国民大宗需求品，其产能的进一步增加对相关行业的经济促进有着重要作用。

维生素C的主要合成方法有莱氏法和二步发酵法。莱氏法是最早应用于维生素C生产的方式，其优点是工艺成熟，产品收率较高，但缺陷是生产程序复杂、劳动强度高以及生产过程大量使用有机溶剂对环境污染较为严重。二步发酵法是本世纪70年代由我国科学家尹光琳提出，用微生物发酵的方法代替了莱氏法中的化学合成步骤。首先通过高压加氢的方式将葡萄糖转化为山梨醇，然后通过氧化葡萄糖酸杆菌发酵将山梨醇转化为山梨糖，再通过混菌发酵将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，最后内酯化反应生成维生素C。另外，还有新二步发酵法与一步发酵法等工艺。葡萄糖可通过欧文氏菌、拉恩氏菌、沙雷氏菌、塔特姆氏菌及泛菌等多个菌属微生物转化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，随后2,5-二酮基-D-葡萄糖酸通过棒状杆菌来源的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶转化成2-酮基-L-古龙酸，该方法为新二步发酵法。1982年，日本盐野义制药的Sonoyama将一株可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的欧文氏菌与棒状杆菌串联发酵，实现了由葡萄糖不经高压加氢的新二步发酵法生成2-酮基-L-古龙酸。1985年，美国的Anderson实验室首次将棒状杆菌来源的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶导入可产2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的欧文氏菌，构建出一株工程菌实现了由葡萄糖一步发酵直接生成2-酮基-L-古龙酸。1988年瑞士Hardy同样构建了类似的工程菌，但葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸的转化率均较低。

为解决上述问题，本申请旨在挖掘和解析葡萄糖一步发酵生成2-酮基-L-古龙酸的主要限速环节，以期在构建完整的2-酮基-L-古龙酸一步合成途径，促使其对合成生物学的发展和维生素产业的进步具有潜在的指导价值和指导意义。

发明内容

本发明提供了一种重组氧化葡萄糖酸杆菌，在出发菌株的基础上，进行了如下至少一种改进：

(1)过表达了氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)来源的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶；

(2)表达了柠檬塔特姆氏菌(Tatumella citrea)来源的编码2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转运蛋白的基因；

(3)敲除或缺失了醛酮还原酶基因bdhAB；所述bdhAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1；编码所述2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶的基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。