[发明专利]一种298位突变的醛酮还原酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于：所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行如下之一的突变获得：（1）第298位的酪氨酸突变成组氨酸；（2）第158位丝氨酸、第298位酪氨酸分别突变为丙氨酸、组氨酸。

2.如权利要求1所述的醛酮还原酶突变体的编码基因。

3.含如权利要求2所述的编码基因的重组表达质粒。

4.如权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于：所述的重组表达质粒的载体为pEASY-Blunt E1，所述重组表达质粒是将所述编码基因插入pEASY-Blunt E1质粒的多克隆位点得到。

5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒按如下方法构建：

（1）以含有质粒pACYCDuet1-SceCPR/EsGDH的E. coli DH5α菌株为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到目的基因：

SceCPR-F   TCATCATCATATGGGCTCATTTCATCAGCAG

SceCPR-R   GTTATGCTAGTCACACTTTCTGGGCCGC

所述质粒pACYCDuet1-SceCPR/EsGDH是将GenBank登录号为EGA59421.1的基因、GenBank登录号为KM817194.1的基因分别插入同一质粒pACYCDuet-1的酶切位点Nco I与Hind III之间、Nde I与Xho I之间得到的；

（2）以pEASY-Blunt E1质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到线性化载体：

pEASY-Blunt E1-F   GAAAGTGTGACTAGCATAACCCCTTGGGGC

pEASY-Blunt E1-R   ATGAGCCCATATGATGATGATGATGATGAGAACCC

（3）通过一步克隆试剂盒将步骤（1）所述的目的基因和步骤（2）所述的线性化载体进行连接，所得连接产物转入感受态细胞中，在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选，挑取单克隆测序验证，提取质粒，得到野生型表达质粒；

（4）以步骤（3）所述的野生型表达质粒为模板，以以下引物进行全质粒定点突变PCR，所得PCR产物纯化后转入E. coli DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选，挑取单克隆测序验证，提取质粒，得到重组表达质粒A：

Y298H-F     CGCCTGCATTGGAACAAACTGTATGGCAAATATAATTATGCG

Y298H-R     GTTCCAATGCAGGCGCAGTGGTTCATGTTCTAAGCCCA

（5）以步骤（3）所述的野生型表达质粒为模板，以以下两对引物依次进行两轮全质粒定点突变PCR，所得PCR产物纯化后转入E. coli DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选，挑取单克隆测序验证，提取质粒，得到重组表达质粒B：

S158A-F     GGCGTGGCAAATTTTGCGGTGGAAGATTTGCAG

S158A-R     AAAATTTGCCACGCCAATATTTTTGGCTTTACCTGACTT

Y298H-F     CGCCTGCATTGGAACAAACTGTATGGCAAATATAATTATGCG

Y298H-R     GTTCCAATGCAGGCGCAGTGGTTCATGTTCTAAGCCCA。

6.一种如权利要求3所述的重组表达质粒构建的重组基因工程菌。