[发明专利]构建阿尔兹海默症的兔模型方法

权利要求书

1.一种构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：以兔MAPT基因11号外显子和/或PSEN1基因4号外显子为靶向，通过点突变的方式改变其遗传序列，使得兔子呈现阿尔兹海默症的表型。

2.根据权利要求1所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：靶向兔MAPT基因11号外显子2098bp处，变异类型为CT，和/或PSEN1基因4号外显子350bp处，变异类型为CT。

3.根据权利要求1所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：其步骤：

（1）根据靶向位点设计与合成SgRNA；

（2）受精卵的获取和显微注射

注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的Cas9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中Cas9mRNA终浓度为150ng/μL；sgRNA终浓度为50ng/μL；

（3）受精卵的体外培养和发育

将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；

（4）胚胎MAPT基因及PSEN1基因突变情况鉴定

①胚胎裂解：胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃，1h；95℃，10min；

②DNA测序鉴定胚胎基因型突变情况：以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；

a、设计PCR引物如下：

MAPT基因上游引物：GACCCAGGAACCTGCATTT (Sense)

MAPT基因下游引物：GACCCAGGCCGCTTTATT (AntiSense)

PSEN1基因上游引物：GGAGATAGAACTTGTGGTGAGG (Sense)

PAEN1基因下游引物：TAGAGAACCACCAGGAGGATAG (AntiSense)

b、PCR反应体系如下：

DNA模板 2μL

上游引物 1μL

下游引物 1μL

2×Taq plus 15μL

ddH₂0 11uL

c、PCR反应条件：

95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；38个循环；72℃延伸5min；

③PCR产物进行测序，测序结果在MAPT基因和/或PSEN1基因引物设计的打靶位点出现相应突变即为编辑成功；

（5）注射后的受精卵移植及动物培育

显微注射后，将受精卵移植，进行胚胎发育，进行规范化饲养，获得阳性转基因兔模型，检测到MAPT基因第2098bp处CT和/或PSEN1基因350bp处CT即为阿尔兹海默症的兔模型。

4.根据权利要求1或3所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：特异性靶向兔MAPT基因和/或PSEN1基因相应位点处的SgRNA，SgRNA序列对应识别的DNA序列如下：

①靶向MAPT基因的SgRNA识别序列：CGTCCCCGGAGGCGGCAGTG

②靶向PSEN1基因的SgRNA识别序列：ACCCCGTTTACAGAAGACAC 。

5.根据权利要求3所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：特异性编辑动物MAPT基因和/或PSEN1基因的SgRNA的PAM序列：

靶向MAPT基因的SgRNA的PAM序列： 5’ -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTG-3’

靶向PSEN1基因的SgRNA的PAM序列： 5’ -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCG-3’ 。

6.根据权利要求1所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：所构建的阿尔兹海默症兔模型自发产生如下阿尔兹海默症表型特征：错误折叠的蛋白质在大脑中的堆积、突触功能受损、神经炎症、认知障碍特征。

7.根据权利要求1、2或3所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：所获得的阿尔兹海默症兔模型在新药的研发、筛选以及疾病机理的探究中的应用。