[发明专利]膜蛋白二聚态原位检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种膜蛋白二聚态原位检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：第一膜蛋白组锚定链、识别探针、第一SERS探针；

所述第一膜蛋白组锚定链包含两条第一膜蛋白锚定链P1-T1和P1-T2，分别用于锚定第一膜蛋白上的两个受体蛋白单体，所述P1-T1和P1-T2能够在所述第一膜蛋白发生二聚时进行邻近杂交，所述P1-T1和P1-T2均依顺序包括：适配体序列、游离序列、杂交序列、触发序列，所述P1-T1和P1-T2的适配体序列和游离序列相同、所述P1-T1和P1-T2的杂交序列之间完全互补且杂交序列仅有6-8个碱基；所述P1-T1和P1-T2的适配体序列分别与两个受体蛋白单体结合，在二聚诱导剂的作用下两个受体蛋白单体形成二聚体时，所述P1-T1和P1-T2则通过杂交序列互补形成双链T型结构；

所述识别探针是通过在大颗粒AuNP上修饰第一RP发夹制备而成，所述第一RP发夹由DNA序列组装而成，能够特异性识别所述第一膜蛋白锚定链的触发序列即与所述双链T型结构形成第一复合体，其中，所述大颗粒AuNP的直径范围40-70 nm；

所述第一SERS探针是通过在小颗粒AuNP上锚定第一SERS发夹和第一拉曼分子制备的，所述第一SERS发夹由DNA序列组装而成且与所述第一RP发夹的序列互补，其中，所述小颗粒AuNP的直径范围10-30 nm，所述第一拉曼分子为4-MBA、DTNB或4-ATP中任意一种。

2.根据权利要求1所述的一种膜蛋白二聚态原位检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于锚定第二种膜蛋白的第二膜蛋白组锚定链P2-T1和P2-T2，所述第二膜蛋白组锚定链也包含两条锚定链，分别用于锚定第二膜蛋白上的两个受体蛋白单体，所述P2-T1和P2-T2同样也能够在所述第一膜蛋白发生二聚时进行邻近杂交形成双链T型结构，所述P2-T1和P2-T2同样的也均包括四个部分：适配体序列、游离序列、杂交序列、触发序列，杂交序列之间为互补关系，且杂交序列也仅有6-8个互补碱基；

所述识别探针为双识别探针，所述双识别探针由第一RP发夹和第二RP发夹同时修饰在所述大颗粒AuNP上制备而成；所述第二RP发夹由DNA序列组装而成，能够特异性识别所述第二膜蛋白组锚定链上的触发序列形成第二复合体；所述第一RP发夹和第二RP发夹的DNA序列无法形成稳定的相互杂交关系，所述第一RP发夹和第二RP发夹分别与第一膜蛋白锚定链的触发序列和第二膜蛋白锚定链的触发序列结合打开发夹结构；

所述检测试剂盒还包括第二SERS探针，所述第二SERS探针是通过在所述小颗粒AuNP上锚定第二SERS发夹和第二拉曼分子制备的，所述第二SERS发夹由DNA序列组装而成且与所述第二RP发夹的序列互补；所述第二拉曼分子选自4-MBA、DTNB或4-ATP中任意一种但与第一拉曼分子不同。

3.根据权利要求1至2中任意一项权利要求所述的膜蛋白二聚态原位检测试剂盒，其特征在于，所述大颗粒AuNP的直径为50 nm，所述小颗粒AuNP的直径为15 nm。

4.根据权利要求1至2中任意一项权利要求所述的膜蛋白二聚态原位检测试剂盒，其特征在于，所述杂交序列仅有7个碱基。

5.权利要求2所述的膜蛋白二聚态原位检测试剂盒在Met蛋白二聚态和TβRII蛋白二聚态同时检测中的应用，所述识别探针为双识别探针，用于两种膜蛋白Met和TβRII蛋白的识别，第一RP发夹即为H1-Met，第二RP发夹即为H1-TβRII；第一SERS探针即为Met-SERS tag，其中第一SERS发夹即为H2-Met；第二SERS探针即为TβRII-SERS tag，其中第二SERS发夹即为H2-TβRII；所述应用步骤包括：首先，在培养基中将待检测细胞与锚定链T-Met-1、T-Met-2、T-TβRII-1和T-TβRII-2共同孵育，使锚定链与细胞膜上相应的Met或TβRII蛋白结合；经过PBS洗涤后，用所述双识别探针和所述Met-SERS tag和TβRII-SERS tag孵育细胞；用PBS清洗细胞后在活细胞上进行蛋白质二聚体的SERS成像。