[发明专利]一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法

说明书

本发明公开了一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：S1、制备第一级催化发夹自组装反应体系(CHA)；S2、制备第二级杂交链式反应体系(HCR)；S3、荧光标记杂交链式反应中HP3链；S4、形成荧光传感器。该基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，通过HP2通过toehold3将Trigger链置换出来，形成稳定的HP1‑HP2链，置换下来的Trigger链又引发新的催化发夹自组装反应，从而形成大量的HP1‑HP2链。HP1‑HP2链也存在toehold末端，游离Toehold端可以触发HP3、HP4的杂交链式反应形成HP2‑HP1‑[HP3‑HP4]n长链复合物。此时分子信标HP3链的发夹结构被打开，荧光基团Cy3和猝灭基团BHQ2分开，发出荧光信号，根据荧光信号的强度实现幽门螺杆菌的特异性定量分析。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.p)是一种革兰氏阴性菌，定植于全球一半以上人口的胃黏膜中，其传染力强，可通过粪－口、口－口、胃－口及医疗器具操作等传播。幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关，感染呈世界性分布，已被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌因子，幽门螺杆菌的早诊断早治疗可以有效减少不良预后的发生率。幽门螺杆菌的临床检测方法分为侵入性和非侵入性。侵入性检测方法包括快速尿素酶试验、组织病理活检、菌体分离培养等；非侵入检查主要包括同位素标记的尿素呼气试验、血清幽门螺杆菌抗体、粪便幽门螺杆菌抗原检测、分子生物学(如PCR)检测等。与侵入式检测方法比较，非侵入检查具有快速、易操作和便于重复检测等优点，适合幽门螺杆菌的流行病学筛查。其中，尿素¹⁴C呼气实验被认为是除细菌培养外诊断幽门螺杆菌感染的金标准，但是该方法有一定放射性，孕妇、哺乳期妇女及12岁以下儿童不宜采用，且检测结果易受药物及上消化道出血等因素的影响，易出现假阴性。因此，急需建立一种灵敏、快速、便捷、普适的检测技术，用于幽门螺杆菌感染的快速准确筛查，为幽门螺杆菌的早诊断早治疗提供技术支撑。

目前文献报道在胃组织、胃液、粪便、牙菌斑等样本中均可检出幽门螺杆菌，血清中也存在幽门螺杆菌抗体。其中胃组织和胃液中幽门螺杆菌含量相对较高，但部分病人难以接受胃镜取样；而粪便标本易于获取，可作为幽门螺杆菌检测的潜在对象，但是由于粪便基质复杂且其浓度较低，常规检测方法难以达到检测的特异性和灵敏度要求。

生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为光、电等可检测信号的仪器，它由识别元件、换能器和信号放大装置三部分组成。生物传感器具有灵敏度高、选择性好、实时检测等优点，在生命科学领域得到了发展和广泛应用。随着适配体的出现，基于DNA的生物传感器不仅可用于检测核酸，也可用于蛋白质、细菌、病毒的等其他生物标志物的检测。同时，为了达到痕量检测的要求，各种核酸放大策略被提出来，如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。PCR灵敏度高，但扩增过程需要精确控制温度，所以难以用于现场快速检测。LAMP的引物设计较为复杂，限制其广泛的应用。近年来，新出现的等温无酶扩增技术，包括催化发夹组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)，具有操作简单，不需要酶催化作用，且信号放大效率高等优点，被广泛的用于传感器的构建。但是由于粪便样本基质复杂且幽门螺杆菌的丰度低，单一信号放大策略难以满足检测要求，多重信号放大策略的联用是未来研究的趋势。

发明内容

针对上述问题，本发明为一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，目前文献报道在胃组织、胃液、粪便、牙菌斑等样本中均可检出幽门螺杆菌，血清中也存在幽门螺杆菌抗体。其中胃组织和胃液中幽门螺杆菌含量相对较高，但部分病人难以接受胃镜取样；而粪便标本易于获取，可作为幽门螺杆菌检测的潜在对象，但是由于粪便基质复杂且其浓度较低，常规检测方法难以达到检测的特异性和灵敏度要求。

本发明的技术方案是：一种基于发夹DNA链的级联DNA组装反应的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：