[发明专利]双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5-15环系二倍半萜类化合物

说明书

本发明涉及双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5‑15环系二倍半萜类化合物。双功能萜合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，双功能萜合酶突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的第89位置的丝氨酸(Serine)突变为亮氨酸(Leucine)后获得的如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的蛋白质。与现有技术相比，本发明通过双功能萜合酶高效精简突变库的构建和突变产物的检测，改造了双功能萜合酶的催化功能，获得了具丰富环系结构的萜类化合物，对有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5-15环系二倍半萜类化合物。

背景技术

萜合酶是萜类化合物生物合成途径中一类重要的酶，负责将萜类线性前体环化形成具有不同环系及对映立体中心的结构。萜合酶复杂精密的催化决定了萜类化合物丰富多样的结构骨架。迄今为止已存在超过80,000种萜类化合物，约占所有天然产物数量的1/3，具有广泛的生物学活性，其中不乏许多著名药物分子，如抗疟疾的青蒿素，抗肿瘤的紫杉醇，抗肝炎药物甘草酸等。

双功能萜合酶主要来源于真菌，同时具有异戊烯基转移酶(prenyltransferase，PT)结构域和萜类环化酶(terpene cyclase，TC)结构域，因此兼具萜类合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate，IPP)首尾相连和环化的双重功能。目前为止，真菌来源双功能萜合酶的催化产物均为二萜和二倍半萜，且多为三环或四环。根据催化机制可知，PT结构域决定了催化合成萜类化合物的碳链长度，而TC结构域则对产物的环系骨架和立体构型起关键作用，且随着环化反应中间体上碳正离子的迁移，产物的环系结构也将逐渐趋于复杂。然而，由于高能碳正离子中间体的存在，环化过程瞬息万变、难以捕捉，也为双功能萜合酶催化机制的研究带来困难。同时，由于双功能萜合酶双结构域及多个柔性区域的存在，蛋白质晶体结构的获取和解析也十分困难，目前为止仍未有一例双功能萜合酶全酶晶体结构，即使是截短的TC结构域也仅有一例，因此，该领域中关于酶的结构和功能关系的了解较为有限。

蛋白质工程方法包括定向进化、理性设计和半理性设计。由于双功能萜合酶蛋白晶体的不足，目前仍缺乏对其空间结构和功能关系的深入认知，理性设计无从下手，且成功率较低，因此并不适用。定向进化是常用的对酶蛋白进行改造和筛选的有效手段，但其随机突变的特性往往导致突变库过于庞大，具有成本高、效率低、周期长等弊端。近年逐渐发展起来的半理性设计采用生物信息学的手段，通过同源蛋白序列比对、蛋白空间立体结构的比较，同时参考已知催化机制等信息，理性选择蛋白质的改造靶点和替代密码子，从而构建较为精简的突变体文库，更有针对性地改造蛋白质。因此，根据有限的双功能萜合酶结构和催化方面的信息，设计和构建高效突变体库，对更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5-15环系二倍半萜类化合物。

本发明通过对一种双功能萜合酶进行突变，得到双功能萜合酶突变体，该双功能萜合酶突变体能够催化复杂结构的二倍半萜类化合物。通过双功能萜合酶催化功能的改造和突变产物的获得，更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种双功能萜合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的丝氨酸(Serine)突变为亮氨酸(Leucine)后获得的如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的蛋白质。