[发明专利]一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

权利要求书

1.一种可从头合成壳寡糖的多酶催化体系，其特征在于，所述催化体系包含来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escherichiacoli MG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodans ORS571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶催化底物合成壳寡糖。

2.根据权利要求1所述的多酶催化体系，其特征在于，所述体系还含有以下任一组合：

(a)腺嘌呤核苷三磷酸和尿苷三磷酸；

(b)来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶、二磷酸腺苷及尿苷二磷酸。

3.利用权利要求1或2所述的多酶催化体系生产壳寡糖的方法，其特征在于，以乙酰氨基葡萄糖为底物，转化合成壳寡糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶和脱乙酰基酶按照相同的酶活量加入反应体系中，每种酶按照每毫摩尔底物添加100～200U；并添加1/2底物浓度的ATP和UTP，在pH6.5～7.5下反应不少于6h；

或者，乙酰氨基葡萄糖浓度为100～500mM，N-乙酰氨基葡萄糖激酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、几丁质合成酶、脱乙酰基酶和多聚磷酸盐激酶的比例为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，且各种酶按照不少于每毫摩尔底物100U的量添加至反应体系中；二磷酸腺苷初始浓度为50～100mM，在30～40℃下反应，多聚磷流加速度为1～100mg/L/min，pH6～8。

5.一种基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中削弱pgm和nagB的表达并敲除murQ，并将编码葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的基因的启动子替换为组成型启动子J23119得到大肠杆菌底盘细胞，在大肠杆菌底盘细胞中表达来源于Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692的N-乙酰氨基葡萄糖激酶、来源于Escherichiacoli MG1655的UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、来源于Azorhizobium caulinodans ORS571的几丁质合成酶和脱乙酰基酶、以及来源于Ruegeria pomeroyi的多聚磷酸盐激酶。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以敲除了lacI序列的pTrc99A质粒为所述几丁质合成酶和脱乙酰基酶的表达载体；在质粒pACYC184上整合trc启动子和rrnBT1终止子，用以表达所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，以核苷酸序列如SEQ ID No.7的RBS序列为N-乙酰氨基葡萄糖激酶和UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因的共表达核糖体结合位点；以pACYCDuet-1质粒为表达载体J23119启动子启动磷酸激酶PPK基因的表达。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖合成酶的NCBIReference Sequence:NP_418185.1；磷酸葡萄糖胺变位酶的NCBI Reference Sequence:NP_417643.1；葡萄糖-1-磷酸N乙酰基转移酶的NCBI Reference Sequence:NP_418186.1。

8.一种全细胞转化生产壳寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求5～7任一所述的基因工程菌以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物生产壳寡糖。