[发明专利]角质酶-酯酶融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种角质酶‑酯酶融合蛋白及其应用，所述角质酶‑酯酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，本发明的角质酶‑酯酶融合蛋白在降解PET时，相较于HRC单酶、以及HRC/PCEST双游离酶，可以显著提高降解效率和终产物对苯二甲酸的得率。且本发明的角质酶‑酯酶融合蛋白具有极高的温度、pH、金属离子、有机溶剂、表面活性剂耐受性，有较好的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白表达技术领域，更具体地，本发明涉及一种角质酶-酯酶融合蛋白(HRC-Linker-PCEST)及其在高效降解PET中的应用。

背景技术

塑料制品因具有良好的耐热性、电绝缘性、生物安全性等特点，被大量用于纺织制造、包装材料等众多领域中。据研究人员统计，全球每年约有1亿吨塑料制品产生，并呈逐年上升趋势。目前已经在超过240种物种体内发现塑料颗粒，如果不加以重视，必然会危及人类自身的生存。

聚酯是由多元醇和多元酸缩聚而得的聚合物总称，一般为线型热塑性树脂。PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)是以石油为原料的一种常见塑料，由TPA(对苯二甲酸)和EG(乙二醇)通过酯键聚合而成。PET广泛应用于包装、建筑、电气等行业，如饮料瓶、薄膜和工程塑料。PET在被广泛应用的同时，由于其废弃物难以自然降解而造成了严重的环境污染。大部分塑料最终都成为垃圾，造成了严重的环境污染问题，引起了社会的极大关注。

通常情况下，PET降解的方法主要分为物理法、化学法和生物法，物理法包括高温重塑等，化学法包括醇解氨解等。这些方法都是建立在高温或极端化学试剂的基础上，降解成本高、容易产生额外的环境污染物。

随着生物技术的发展，生物降解PET具有很大的应用前景。与化学降解法相比，生物法不仅大大降低了降解成本，而且不产生额外的污染物。生物法主要通过微生物作用将PET大分子聚合物降解。由于PET大分子无法进入微生物体内，微生物需要通过分泌一些胞外降解酶，将PET聚合物降解成小分子量的水溶性小分子，这些水溶性小分子再被吸收到微生物体内，通过体内酶的进一步消化，最终水解成水、二氧化碳等物质。研究人员从这些微生物中分离鉴定出在体外发挥降解作用的功能酶，研究发现这些降解酶可以将PET水解成MHET(对苯二甲酸乙二醇酯)、TPA、EG等原料成分。这些降解酶的作用不仅解决了PET塑料的污染问题，而且可以进一步回收原料成分，更加绿色环保，因此微生物酶降解法具有很大的应用前景。

研究人员以PET或其模拟物作为底物，在堆肥中进行菌株筛选，分离出多种具有降解活性的微生物，为了进一步研究PET的生物降解，研究人员尝试从这些降解菌株中分离出具有降解活性的微生物酶。在这些微生物酶中，由于角质酶的催化中心不存在“盖子”结构，有助于酶识别PET聚合物底物，因此角质酶及其同系物相较其他酶表现出较高的降解能力。2016年日本科学家从垃圾场里已经发生自然侵蚀的PET上分离并鉴定了一种对PET有一定降解能力的细菌(Ideonella sakaiensis)，并且重组表达了该菌降解PET的关键水解酶，将其命名为PETase，这是首个以PETase命名的PET水解酶(之前的研究一般是用酯酶、脂肪酶、角质酶等水解酶来降解PET)。但该酶仅可以在常温下缓慢降解PET，且降解效率不高。