[发明专利]一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：引物及探针的设计与合成，根据NCBI数据库中CMV的外壳蛋白基因保守序列EF417579.1和HSC70-1基因DV161835，根据引物和TaqMan探针设计原则，Primer Premier5.0软件设计荧光定量PCR检测的引物及探针，并通过NCBI中的Primer-BLAST进行比对，保证所设计引物的特异性；

其中，上游引物CMV-F： CGGAGTCCAAGCCAACAAT；下游引物CMV-R：GAAGTACCAGCTCATCCGTCTC；探针：FAM-ATATCAGCGCGCATC-MGB；所述的EF417579.1的序列表为SEQ ID No.1 所示，DV161835的序列表为SEQ ID No.2所示；

步骤二：烟草总RNA的提取与RT-PCR，采用Trizol法提取植物总RNA，用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；进行cDNA第一链的合成反应体系并进行PCR反应体系；

步骤三：目的基因鉴定，将步骤二中的PCR反应体系所产生的产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，胶回收试剂盒纯化回收后，连接至pMD™18-T Vector，并转化进入感受态细胞Trans 5α，37℃过夜培养后经蓝白斑筛选，分别挑选白色单菌落和蓝色单菌落置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中分开震荡培养，使用天根质粒提取试剂盒完成质粒的提取；提取的质粒用pMD™18-T Vector的通用引物BcaBEST Sequencing Primers、M13Primers进行PCR鉴定，且进行PCR反应，从而得到PCR产物，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合预期大小目的条带的质粒样品送进测序，余下的质粒样品保存于-20℃内；

步骤四：质粒标准品的制备，质粒样品经测序鉴定无误后，用分光光度计测定质粒OD260的值，通过公式：C=A/B×6.02×10¹⁴，计算出质粒浓度拷贝数，将其作为质粒标准品使用；

步骤五：标准曲线的建立，将质粒标准品用EASY Dilution进行10倍梯度稀释，分别获得CMV终浓度为2.32×10²—2.32×10⁸copies/µl的9个质粒样品、内参基因终浓度为5.03×10¹—5.03×10⁹copies/µl的9个质粒样品，以稀释后的质粒样品作为模板，利用ABI 7500fast实时荧光定量PCR仪进行RT-qPCR，每个浓度进行三次技术重复，通过仪器自动生成标准曲线。

2.根据权利要求1所述的用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中采用Trizol法提取植物总RNA包括取出0.1g CMV烟草病毒样本，使用Trizol试剂提取总RNA，以健康烟草叶片为阴性对照。

3.根据权利要求1所述的用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中cDNA第一链的合成反应体系包括RNA 2µl、Random Primer 1µl、DEPC-ddH2O 7µl，先65℃保育5min，快速置于冰上放置2min以上，后加入以下试剂：5×RT buffer5µl、RRI 0.5µl、M-MLV 1µl、dNTPmix 5µl、DEPC-ddH2O 3.5µl，反应条件：30℃10min，42℃60min，70℃15min，制得的cDNA置于-20℃保存用于后续试验。

4.根据权利要求1所述的用于检测黄瓜花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述的步骤二中PCR反应体系包括Premix Taq 10µl，10µmol/L的上下游引物各0.5µL，cDNA 2µl，ddH2O 7µl，反应程序依次为95℃预变性3min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，并经过35次循环，最后在72℃延伸10min。