[发明专利]NK细胞的制备方法及其抗癌的应用

说明书

本申请涉及NK细胞的制备方法及其抗癌的应用。本申请提供了一种抗CD20抗体，可与目标抗原高水平结合；提供了一种药物组合物，包括所述抗CD20抗体和经过基因修饰的NK‑92细胞，该细胞中导入了IL‑2突变体基因，所述人IL‑2突变体具有全新的氨基酸结构，在天然IL‑2序列基础上进行了多点突变尝试，其具有更强的NK‑92细胞促增殖能力和肿瘤细胞毒性；IL‑2突变体基因导入NK‑92细胞中，使其能够自主持续分泌该细胞因子，既能够满足自身需要，又能够避免全身给药造成的过重负担；所述经过基因修饰的NK‑92细胞与抗CD20抗体联用可在体内、体外有效杀伤肿瘤细胞，抑制白血病等血液肿瘤的生长和发展，延长模型动物生存期，调解TNF‑α、IFN‑γ等细胞因子的表达水平，强化抗肿瘤作用。

技术领域：

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了NK细胞的制备方法及其抗癌的应用。

背景技术：

癌症是严重危害人们生命健康的恶性疾病，在世界各个国家或地区的发病率、死亡率居高不下。癌症根据其生理特性和发生部位可以分为实体肿瘤和血液肿瘤，其中白血病是最主要的血液肿瘤之一。白血病由于白细胞异常增殖而产生，根据增殖速度，它们可分为急性或慢性白血病；根据起源细胞，可分为髓系或淋巴系白血病。白血病主要的亚型包括急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性髓性白血病(chronic myeloidleukemia，CML)；和涉及淋巴链的急性淋巴细胞白血病(chronic myeloid leukemia，ALL)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)；其他不太常见的变体，例如成熟的B细胞和T细胞白血病、NK细胞相关的白血病等等，均来自成熟的WBC细胞。

白血病的发生和发展与多种遗传和环境风险因素有关，最近研究结果表明，电离辐射、危险化学品、化疗药剂(如烷化剂和拓扑异构酶抑制剂)、病毒感染(如人类T细胞白血病病毒、Epstein Barr病毒)、遗传综合征(如唐氏综合征、范可尼贫血、布鲁姆综合征、李-弗拉美尼综合征)等均可使得患白血病的风险增加。据世界卫生组织统计，全球白血病发病人数已达48万例，死亡率约为32％，而我国由于治疗手段相对落后，死亡率高达50％。

目前癌症的传统治疗手段以手术、放疗和化疗为主，虽然上述方法经过数十年的发展日臻成熟并挽救或延长了无数癌症患者的生命，但是面对肿瘤的新变化，尤其是耐药性、复发性、转移性癌症的出现，而显得越来越捉襟见肘。近年来出现的肿瘤免疫疗法，似乎给出了新的解决方案，这种疗法目的是增强对肿瘤细胞的免疫反应，进而借助机体自身的免疫机制抑制甚至杀死肿瘤细胞，并可与化学疗法、手术、放射疗法和靶向小分子结合使用，免疫肿瘤药物包括广泛的药物，包括抗体、疫苗、辅助疗法、细胞因子、溶瘤病毒、双特异性分子和细胞疗法。其中过继性细胞转移疗法取得了疗效最为显著，也受到了更多的关注，这种方法最初是输注淋巴细胞于患者体内治疗肿瘤，1980年代过继细胞移植的首次成功临床应用是基于在转移性黑色素瘤患者中使用自体肿瘤浸润淋巴细胞和在复发性白血病患者中输注同种异体供体淋巴细胞；1990年代随着基因技术的发展，通过使用T细胞受体或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)来改善免疫细胞特异性成为可能，这种方式增强了T细胞的识别功能和杀伤功能，并且一旦注入患者体内CAR-T细胞就会在患者体广泛增殖，通过抗原释放、协助肿瘤浸润淋巴细胞攻击肿瘤或通过自身的持久性来促进免疫监视以防止肿瘤复发，目前这种方法在血液瘤的治疗中取得了巨大成功，世界范围内已经有多种药物批准上市。然而以T细胞为基础的免疫疗法却具有如下缺点：(1)移植抗宿主反应，难以形成通用型细胞系，多以个体T细胞进行基因改造，过程繁琐、成本较高且易产生污染风险；(2)免疫因子风暴，治疗中常伴随大量免疫因子释放，引发严重不良反应；(3)神经毒性，T细胞侵入大脑引发致命的脑水肿等等。