[发明专利]KRAS基因突变检测引物组及其应用

说明书

本发明涉及核酸检测技术领域，具体公开了KRAS基因突变检测引物组及其应用。本发明将常规PCR扩增、LNA阻断引物与测序技术相结合，建立了一种简单快速、高灵敏性、高特异性且低成本的KRAS基因突变检测方法。本发明提供的阻断引物可以选择性地与野生型DNA模板结合，由于阻断引物G12和G13对应位置采用LNA核苷酸，阻断引物与野生型DNA模板结合力强，因此其一旦与野型DNA结合便会阻止野生型DNA模板的扩增。阻断引物对Taq DNA聚合酶的5’外切酶活性不敏感，且不与突变型DNA模板结合，突变序列的扩增不受影响而得到优势扩增，野生序列扩增会明显受到抑制。结合PCR产物测序，可对患者肿瘤组织KRAS基因突变进行快速检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及KRAS基因突变检测引物组及其应用。

背景技术

KRAS是一种原癌基因，基因全长35kb左右，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控。KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因，其最常见的突变位点主要在2号外显子的第12、13密码子上，突变频率在90％以上。监测KRAS在体内突变情况的变化有助于理解基因改变与病情发展之间的联系。具体区分KRAS的突变类型也有助于针对性地进行药物研发。

随着分子生物学的快速发展，更多的分子生物学方法被用于检测人KRAS基因突变，包括测序、基因芯片、探针杂交、Q-PCR等，直接测序法虽然反应体系简单，易于操作，但目前通过直接对PCR反应产物进行测序的方式来实现KRAS基因突变检测，存在灵敏度低，很难满足检测需求的问题。因此，有必要对该方式进行进一步研究，以实现提高KRAS突变检测的准确性和灵敏度，使其符合临床诊断要求的目的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种新的KRAS基因突变检测引物组及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套KRAS基因突变检测引物组(引物系统1)，其包括引物KRAS-F2-1、KRAS-R2-1和阻断引物KRAS-BLK，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No：1-3所示：

KRAS-F2-1：5′-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCT-3′；

KRAS-R2-1：5′-CTACCCTCTCACGAAACTCTG-3′；

KRAS-BLK：5′-PO₄-gagct(LNA)g(LNA)gtg(LNA)gcgtagg-PO₄-3′；

其中，PO₄表示磷酸化修饰，LNA表示其右侧的核苷酸经锁核酸修饰。

本发明通过对目标基因的靶区进行特定选择，进而设计了引物系统1，其可用于检测KRAS基因第12、13密码子G12和/或G13的突变位点，结合PCR产物sanger测序技术，既能实现KRAS突变基因的检出，又能实现具体突变基因的分型，其灵敏度高、准确性强，克服了现有PCR产物直接测序方法的缺陷，提供了一种体系简单、操作简便的KRAS基因突变检测新方法。

具体地，KRAS基因组局部序列如SEQ ID NO：9所示，该序列中第262位至383位所显示的序列为外显子，第306位至308位为G12位点，第309位至311位为G13位点，第286位至第305位所显示的序列为引物KRAS-F2-1所对应的设计位点，第626位至第646位所显示的序列为引物KRAS-R2-1所对应的设计位点，第301位至第316位所显示的序列为引物KRAS-BLK所对应的设计位点。