[发明专利]一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，含有编码乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的表达载体；宿主菌为运动发酵单胞菌；所述乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC来自于枯草芽孢杆菌，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。

3.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，将异源的权利要求1所述的乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因连接在表达载体上，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或者将乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因构建至运动发酵单胞菌基因组上，获得利用alsSD途径生产乙偶姻的基因工程菌株。

4.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，构建分别由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd、P_ppc和P_xsea调控由乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC组成的alssD操纵子的单操纵子表达盒；或乙酰乳酸合成酶由启动子P_tet、P_pdc、P_tuf、P_zwf、P_eda、P_eno、P_clcd调控，α-乙酰乳酸脱羧酶由P_gap启动子调控的双启动子表达盒，将构建的表达盒转化至运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌。

5.根据权利要求3或4所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，在获得重组运动发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl和过氧化氢酶cat，获得工程菌株。

6.根据权利要求1-2任意一项所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。

7.一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；

（2）发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD₆₀₀=0.15将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为30℃，并在150rpm的摇床速度下以及20g/L－100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。