[发明专利]包含碱性磷酸酶标记抗体的检测试剂盒

说明书

本发明涉及包含碱性磷酸酶标记抗体的检测试剂盒。本发明提供金黄色葡萄球菌的肠毒素A的单克隆抗体与现有技术的单克隆抗体相比，具有更高的灵敏度和特异性。将所述单克隆抗体制备成为ELISA检测试剂盒可以具有最低检测下限可以达到0.1ug/L的灵敏度，并由此开发了快速简易的免疫检测产品，应用价值广泛。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体的涉及一种包含碱性磷酸酶标记抗体的检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素很稳定，不易被破坏。金葡菌可产生A、B、C、D、E、F等多种肠毒素。金葡菌性食物中毒以A型肠毒素引起者最多。肠毒素对热的抵抗力极强,加热至100℃、30分钟不能完全破坏，仍能使人致病，其中以B型最耐热，C型次之，A型最差。

目前，针对金黄色葡萄球菌的检测主要是以检测A型肠毒素为主。在检测中，通常有分子生物学的方法以及免疫学的方法，当然还有动物学试验方法，常选用幼猫和猴为受试对象，喂食或腹腔注射含有肠毒素的菌株培养液，动物会发生呕吐、腹泻等现象。由于各种动物对肠毒素反应的敏感性不一致，灵敏性差，容易产生假阴性结果；其他非肠毒素类物质可以对肠毒素的作用产生干扰，也容易产生假阳性的结果。另外实验用动物来源困难，成本较高，这种方法的应用受到很大的限制。分子生物学方法在肠毒素基因检测、研究肠毒素基因的表达情况和各型之间的关系，深入认识其毒素性质方面的重要作用日益凸显。此方法快速敏感、特异性强、操作简便、重复性好、检测周期短、使用标本量少，可用于高流通量检测，近年来发展迅速，在食物中毒检测、临床诊断、流行病学调查中具有重要的应用价值，但是分子生物学方法通常需要使用PCR仪，在应用时具有器材上的局限性，并不适宜于大面积使用或者在偏远地区快速检测使用。

适配体传感器方法虽然特异性和灵敏度较好，但存在操作复杂和技术不稳定等问题。已经建立的定量检测肠毒素蛋白的方法主要还是基于免疫学方法。其中，酶联免疫法(ELISA)是利用抗体与对应抗原发生特异性结合这一性质，通过将特定抗体/抗原作为选择性试剂来对相应待测抗原/抗体进行分析测定的方法，具有分析时间短、灵敏度高、特异性好的优点。目前已经建立了双抗夹心(double-antibody sandwich，DAS)-ELISA检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素的方法，

比如IN340119A1中就公开了一种特异性检测样品中金黄色葡萄球菌肠毒素B产生菌株的斑点ELISA方法，包括：(a)在添加浓度为0.5mM-5mM的EDTA的选择性富集胰蛋白胨酵母提取物肉汤中从样品中培养培养10-12小时；(b)干燥斑点在硝酸纤维素膜上的培养物；(c)用5％的封闭剂在磷酸盐缓冲盐水中在环境温度下封闭硝化纤维素膜40-50分钟；(d)将阻断的硝酸纤维素膜与兔抗蛋白A以1:300-1:500的浓度孵育1小时，其中兔抗蛋白A与金黄色葡萄球菌产生的可溶性和表面蛋白A结合，减少葡萄球菌蛋白A对斑点ELISA的干扰；(e)用产生的单克隆抗体SE-241孵育前一步骤中与兔抗蛋白A孵育的阻断的硝酸纤维素膜持续45分钟，所述单克隆抗体的特征在于抗重组嵌合TE蛋白；(f)用酶标记的二抗孵育用兔抗蛋白A和单克隆抗体SE-241孵育的硝酸纤维素膜；和(g)基于与酶-底物反应相关的颜色变化，检测样品中是否存在产生肠毒素B的金黄色葡萄球菌菌株。但是目前，针对肠毒素A的检测还不够多。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种特异性针对金黄色葡萄球菌肠毒素A的单克隆抗体4H5，其轻链可变区的氨基酸序列为：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTAHIWGQAEDHALYWFLQRPGQSPQLLIYCSPNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCSEDCLIRLCFGSGTKLEIK

重链可变区的氨基酸序列为：