[发明专利]一种猪瘟病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒E2‑E0融合蛋白、制备方法及应用。本发明首先提供了一种猪瘟病毒E0截短蛋白与猪瘟病毒E2蛋白的E2‑E0融合蛋白，不仅能够促进E0蛋白的表达，而且不影响E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于猪瘟亚单位疫苗的制备；在上述猪瘟病毒E0截短蛋白的基础上，本发明发现，将猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G，能够使E2‑E0融合蛋白的表达量进一步提升20％以上，且不影响其免疫原性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用。

背景技术

猪瘟(Classicalswinefever，CSF)又称猪霍乱(Hogcholera，HC)是由猪瘟病毒(HogCholeravirus，HCV或Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40-60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其多聚蛋白上从N到C端的顺序依次为：N^pro、C、E0(E^rns)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除C、E0、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白C和E012前体之间剪切多聚蛋白，随后在E2的C端剪切开，最后E012被迅速剪切成E01和E2。在E2从E012前体释放以后，E01被加工成E0和E1，最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物，组装成病毒粒子结构。

目前采取以预防为主的综合防控策略防控猪瘟，其中灭活疫苗是猪瘟田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，但是，传统的灭活疫苗存在免疫持续期短，在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。基于此，研究者长期致力于CSF亚单位疫苗的研发。E0蛋白能够诱导机体产生病毒中和性抗体，是CSFV的重要保护性抗原，也是CSF亚单位疫苗研制的候选抗原。E0蛋白的氨基酸序列中存在多个糖基化位点，对于保持其抗原性具有重要作用。通过原核大肠杆菌对E0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了CSF亚单位疫苗的研发。

发明内容

为了解决CSFV E0蛋白在CHO细胞中表达量低或不表达的技术问题，本发明经过大量研究发现，将CSFV E0蛋白进行截短并将其与CSFV E2蛋白融合后能够在CHO细胞中促进CSFV E0的表达，既不影响E2蛋白的表达，且不影响E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于CSF亚单位疫苗的制备，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种猪瘟病毒E2-E0融合蛋白，所述融合蛋白包括猪瘟病毒E0截短蛋白和猪瘟病毒E2蛋白；所述猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，编码所述猪瘟病毒E0截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述猪瘟病毒E2-E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，编码所述猪瘟病毒E2-E0融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。