[发明专利]一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法

权利要求书

1.一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

初次孵育：将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：1～8的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到初次孵育产物；

二次孵育：将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：8～16的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到二次孵育产物，即为目标产物Dodecamer；

外周血样本准备：收集受试者的新鲜外周血样本；

外周血单个核细胞准备：从步骤c)中所收集的新鲜外周血样本内分离出外周血单个核细胞；

三次孵育：将6～10ul的步骤b)中所制备的Dodecamer与3～7ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到三次孵育产物；

鉴定和分选：检测步骤e)中所制备的三次孵育产物内的对荧光染料呈阳性的细胞群并进行分选，得到目标细胞群；

染色和鉴定：对步骤f)中所分选的目标细胞群进行免疫荧光染色和荧光原位杂交鉴定。

2.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤a)中，将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：4的摩尔比例进行混合。

3.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤a)中，荧光染料为PE荧光染料。

4.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤a)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为常温。

5.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤b)中，将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：12的摩尔比例进行混合。

6.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤b)中，抗体为EpCAM抗体。

7.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤b)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为常温。

8.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤e)中，将8ul的步骤b)中所制备的Dodecamer与5ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞进行混合。

9.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤e)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为4℃。

10.如权利要求1所述的一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于：在所述步骤f)中，按照常规流式细胞仪操作方法检测步骤e)中对荧光染料（PE）呈阳性的细胞群并进行分选。