[发明专利]一种草地早熟禾谷氨酰胺合成酶基因PpGS1.1启动子的克隆及其应用

权利要求书

1.一种草地早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子，其特征在于：所述的PpGS1.1基因启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的PpGS1.1基因启动子在拟南芥的茎中、根尖分生区和相对成熟叶片中表达显著；在根中表达不均匀；在幼嫩的子叶中表达不显著；所述的PpGS1.1基因启动子在烟草叶片中拥有转录活性。

2.获取权利要求1所述的一种草地早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子片段的引物，其特征在于，所述的引物序列如下：

SP1：5'GCGGCCATGACAAGAATAAGAAG3'；

SP2：5'GCGATGATCTTCTCGGTGGTGT3'；

SP3：5'AGATCGGTGAGGAGCGCCATAA3'；

SP4：5'TCGAACCGATGTACCGTATATGG3'。

3.包含权利要求2所述的引物的试剂盒。

4.采用权利要求2所述的引物克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子片段的方法，其特征在于，它是按照如下方式进行的：

步骤一、提取草地早熟禾的基因组DNA；

步骤二、以草地早熟禾的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物，即得所述的PpGS1.1基因启动子片段。

5.根据权利要求4所述的克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子片段的方法，其特征在于，所述的PCR扩增是分四轮PCR扩增完成的，具体为：

第一轮PCR扩增：以草地早熟禾的基因组DNA为模板，采用简并引物以及SP1作为引物进行扩增；

第二轮PCR扩增：取第一轮PCR扩增产物为模板，采用简并引物以及SP2作为引物进行扩增；

第三轮PCR扩增：取稀释100倍第二轮PCR扩增产物为模板，采用简并引物以及SP3作为引物进行扩增；

第四轮PCR扩增：取稀释100倍第三轮PCR扩增产物为模板，采用简并引物以及SP4作为引物进行扩增。

6.根据权利要求4或5所述的克隆早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子片段的方法，其特征在于，

所述的PCR扩增是分四轮PCR扩增完成的，其中，第一轮的PCR扩增体系如下：

第一轮的PCR扩增条件如下：

第二轮的PCR扩增体系如下：

第二轮的PCR扩增条件如下：

第三轮的PCR扩增体系如下：

第三轮的PCR扩增条件如下：

第四轮的PCR扩增体系如下：

第四轮的PCR扩增条件如下：

。

7.一种克隆含有Hind Ⅲ和Sma Ⅰ酶切位点的草地早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子的引物，其特征在于，所述的引物序列如下：

F1：5'CCCAAGCTTTCCGATTAGTATTGCCGTGAT3'；

R1：5'TCCCCCGGGTGATCTTCTCGGTGGTGTCG3'。

8.采用权利要求7所述的引物获取得到的含有Hind Ⅲ和Sma Ⅰ酶切位点的PpGS1.1基因启动子，其特征在于：所述的PpGS1.1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.采用权利要求7所述的引物克隆含有Hind Ⅲ和Sma Ⅰ酶切位点的早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1.1基因启动子的方法，其特征在于，它是按照如下方式进行的：

以草地早熟禾的基因组DNA为模板，采用权利要求7所述的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳，回收得到1511bp 的PCR产物，即得所述的PpGS1.1基因启动子。