[发明专利]一种干细胞外泌体高纯度提取方法

说明书

本发明公开了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体原液；(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，获得外泌体超速离心体系；(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀。本发明采用PEG交联成网状，附着外泌体；通过加入蔗糖溶液进行外泌体保护，避免了外泌体在超速离心过程中遭到地破坏，从而稳定外泌体、提高外泌体提取物的纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种干细胞外泌体高纯度提取方法。

背景技术

干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。干细胞在生命科学的细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景，对于发育研究、基因功能研究有着重要意义，同时可作为疾病基因治疗的载体、作为药物筛选平台等等。研究表明，干细胞的外泌体，包括重要的调控信号，例如miRNA，具有调节细胞节律如免疫、细胞周期的重要功能。

人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)是典型的成体干细胞之一；与其他来源的干细胞相比，它们具有免疫原性低、易于体外扩增、无创性获取和伦理获取等优点。因此，HUC-MSCs是一种很有前途的细胞治疗用干细胞来源。早期研究显示人脐带间充质干细胞参与许多重要的生物学功能，如归巢、转分化和免疫调节。最近的研究表明，MSCs的旁分泌作用通过外泌体(分泌外囊泡)在细胞修复和再生中起到了重要作用。

作为一种囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)，外泌体(Exosomes)其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物(包括核酸、蛋白和脂质等)，参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脐带组织、肌肉组织、脂肪组织、胎盘组织、脑组织。

目前,分离外泌体最常用的提取方法为超速离心法、色谱法、以及密度梯度离心法。其中，密度梯度离心效率过低、色谱法成本太高，二者都难以大规模生产。超速离心法是最有希望的工业化适合大规模生产的外泌体提取方法。然而，超速离心法得到的外泌体的量还较少，纯度也不高。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，其目的在于通过采用PEG交联网状结构稳定外泌体，并采用蔗糖溶液进行外泌体保护，可承受更多次、更高效的超速离心进行外泌体提纯，从而获得更高纯度、质量更稳定的干细胞外泌体，由此解决现有的超速离心发提纯外泌体纯度不高、外泌体遭到超速离心破坏导致稳定性不佳的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，其包括以下步骤：

(1)收集外泌体原液；

(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；

(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，获得外泌体超速离心体系；

(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀。

优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其还包括以下步骤：

(5)清洗保存：将步骤(4)中获得的提纯的外泌体沉淀，采用海藻糖或PBS清洗并重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体保存。