[发明专利]过表达牛TUSC5a和TUSC5b基因重组慢病毒的构建方法及其应用

权利要求书

1.牛TUSC5a和TUSC5b基因在肉牛脂肪沉积调控中的应用，TUSC5a的表达显著促进脂肪合成与积累，TUSC5b的表达显著抑制脂肪合成与积累，TUSC5a序列如SEQ ID No.1所示，TUSC5b序列如SEQ ID No.2所示。

2.过表达牛TUSC5a和TUSC5b基因重组慢病毒在肉牛脂肪沉积调控中的应用，慢病毒将TUSC5a和TUSC5b整合到基因组内基因表达进而调控脂肪沉积，TUSC5a的表达显著促进脂肪合成与积累，TUSC5b的表达显著抑制脂肪合成与积累，TUSC5a序列如SEQ ID No.1所示，TUSC5b序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种调控肉牛脂肪沉积的人工制剂，其特征在于：包括过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒。

4.过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒的构建方法，其特征在于：包括使用内切酶将携带HIS标签的TUSC5a/TUSC5b序列分别与慢病毒载体双酶切，胶回收后产物经连接酶连接，得到过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒的步骤；

所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro，经连接酶连接后的所述慢病毒载体上添加的序列为：

5'-ccg+GAATTC+ATG+TUSC5a/TUSC5b序列+CATCATCACCATCACCAT+CCTAGG+cgc-3'，

其中，TUSC5a序列如SEQ ID No.1所示，TUSC5b序列如SEQ ID No.2所示，连接TUSC5a序列后慢病毒载体上添加的序列如SEQ ID No.3所示，连接TUSC5b序列后慢病毒载体上添加的序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于：还包括TUSC5a/TUSC5b序列克隆的步骤，具体为：

从牛脂肪组织中得到的cDNA，以TUSC5a-F和TUSC5a-overlap-R作为引物对TUSC5a的第一个片段进行扩增，以TUSC5a-overlap-F和TUSC5a-RED1-R2为引物对TUSC5a的第二个片段进行扩增；将PCR产物胶回收后，作为模板，以TUSC5a-F、TUSC5a-RED1-R2为引物，进行扩增得到TUSC5a序列；以TUSC5a-F、TUSC5a-RED1-R1为引物，进行扩增得到TUSC5b序列，通过Hind I、KpnI双酶切后，胶回收产物经T4连接酶构建TUSC5a-RED1、TUSC5b-RED1；

其中，各引物的序列如下表：

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于：还包括TUSC5a/TUSC5b序列添加HIS标签的步骤，具体为：

以TUSC5a-RED1为模板，使用引物TUSC5a-F、TUSC5a-R扩增出携带HIS标签的TUSC5a序列；

以TUSC5b-RED1为模板，使用引物TUSC5b-F、TUSC5b-R扩增出携带HIS标签的TUSC5b序列；

其中，各引物的序列如下表：

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于：

TUSC5a-RED1的PCR扩增体系(20μL)如下表：

TUSC5b-RED1的PCR扩增体系(20μL)如下表：

8.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于：还包括将过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒整合到宿主染色体上，构建TUSC5a/TUSC5b稳转细胞株的步骤。

9.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于：还包括过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒包装的步骤，通过过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒和Pspax2、PMD2.G三质粒慢病毒包装体系，利用293T细胞作为包装细胞，包装慢病毒。

10.根据权利要求9所述构建方法，其特征在于：Pspax2：PMD2.G：过表达牛TUSC5a/TUSC5b基因重组慢病毒按照体积比2：3：4的比例混合。