[发明专利]修饰线性核苷酸的方法、用于探针延伸的试剂

说明书

本发明涉及一种修饰线性核苷酸的方法、用于探针延伸的试剂。修饰新乡核苷酸的方法包括：获取作为底物的线性核苷酸acyNTP，acyNTP包括acyATP、acyCTP、acyGTP以及acyTTP；通过ddTTP替换acyNTP中的acyTTP；并与acyATP,acyGTP,acyCTP进行混合；优化ddTTP与acyATP、acyCTP、acyGTP的浓度比例，以使四种核苷酸保持相当的延伸效率；通过将修饰的核苷酸应用到核酸质谱的基因分型检测中，保证单碱基延伸酶对不同结构的核苷酸延伸效率相当的同时，使产物分子量之间差异大于9Da，可用于常规飞行时间质谱。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及修饰线性核苷酸的方法、用于探针延伸的试剂。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在人群中发生的频率高于1％，是人类可遗传的变异中最常见的一种，因此，SNP的检测对遗传病的诊断、筛查以及用药等方面有及其重要的指导作用。

目前，SNP检测的方法学主要包含实时荧光PCR法、PCR基因芯片法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法、流式荧光杂交法、飞行时间质谱法，焦磷酸测序法、Sanger测序法等。其中，实时荧光PCR法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法和流式荧光杂交法的优点在于耗时较短、灵敏度较高，能够实现某些场景下的检测，但因其通量有限，所以无法方便快捷地满足临床对于数十个甚至数百个基因位点的检测需求。基因芯片法、焦磷酸测序法和Sanger测序法，虽然检测较为准确，但检测成本较高，耗时较长，并不是SNP检测的首要选择。而飞行时间质谱法，检测速度快，数据分析简单，通量较高，即弥补了传统方法学的不足，又降低了成本，相比前面几种方法是一种更好的选择，但却存在检测结果不够准确的问题，使其应用的进一步发展受到了限制。

核酸质谱SNP检测主要基于PCR和引物延伸技术，其原理是首先通过PCR引物对待检测SNP位点的目标片段进行扩增，产生的PCR产物经过虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase,SAP)处理残留的dNTPs，使其无法作为延伸的原料。SAP消化反应结束后，向反应液中加入缓冲液，延伸引物，双脱氧核糖核苷酸以及单碱基延伸酶等组分进行单碱基延伸反应。以DNA扩增产物为模板，延伸探针与待检测SNP位点的5’端紧密结合，延伸一个碱基后由于双脱氧核糖核苷酸作用使延伸反应终止。引物延伸完成后，向反应液中加入离子交换树脂进行脱盐纯化处理，去除吸附在核酸片段上的副产物金属离子。脱盐完成后，将样品与基质转移到靶板形成共结晶，通过质谱检测获得谱图。通过计算谱图中产物的分子量与延伸引物的分子量的差值可分析该样品SNP位点的分型。

然而，以ddNTP作为底物时，单碱基延伸酶的结合效率低，延伸效果差，影响谱图结果判断的准确性。另外一种可用于单碱基延伸的核苷酸底物为线性核苷酸(acyclonucleotides，acyNTP)，线性核苷酸为一种核苷酸类似物，其结构中没有常规核苷酸中的5元环结构，而是将3，4号位的“-CH2-”结构去除，整个分子结构呈现线性。acyNTP尤其适用于古生菌DNA聚合酶的反应，特别是Therminator DNA聚合酶。Therminator DNA聚合酶经过基因工程改造后，拥有更强的掺入核苷酸类似物的能力，特别是acy碱基类似物，对于acyNTP的识别效率为普通ddNTP的30倍。

现有技术中acyNTP作为底物主要应用于测序，在核酸质谱SNP检测中应用较少。acyNTP作为底物时，acyCTP、acyATP、acyGTP和acyTTP分子量分别为425.12、449.12、465.14、440.1。

明显的acyATP与acyTTP核苷酸之间分子量的差异为9Da，然而飞行时间质谱仪很难有效区分9Da差异的特征峰，尤7000Da 12000Da的大分子质量检测区间内，也因此导致质谱仪无法对SNP进行精准分型。

本申请旨在建立一种修饰线性核苷酸的方法以使得各个核苷酸之间分子量可以区分，提高谱图分辨率与结果判读准确率。