[发明专利]基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，具体公开了基于表面等离子共振成像技术检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用。所述方法包括：将非小细胞肺癌细胞外泌体注入双通道流动池中，与修饰非小细胞肺癌相关蛋白抗体的SPRi芯片靶向识别与结合；随后加入功能化金纳米颗粒修饰的外泌体特异性抗体，靶向结合SPRi芯片上吸附的外泌体，在芯片表面形成特异性抗体/外泌体/金纳米颗粒的“三明治”结构，通过SPRi分析仪检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的表达差异性。本发明通过SPRi生物传感平台确定NSCLC来源的外泌体的群体和亚型，在临床应用中具有高灵敏度、免标记和多组分检测的优势。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用。

背景技术

近年来，大量研究表明，肿瘤细胞(比如非小细胞肺癌，NSCLC)会向外周血分泌外泌体(Lobb et al.，2017；Wang et al.，2018)，它们携带肿瘤特异性分子。因此，在外周血中探测特定的肿瘤(比如非小细胞肺癌)来源的外泌体成为这些恶性癌症早期筛查与临床诊断的新方向。

传统的用于分析肿瘤来源外泌体的方法，如Western blot、ELISA和质谱分析，由于过程漫长和繁琐，限制了其临床应用。到目前为止，已经有一些用于测定肿瘤来源的外泌体的新方案(Ferhan等人，2018；Shao等人，2018)。例如，以前的研究报道了表面增强拉曼散射(SERS)免疫分析，以高灵敏度特异性检测胰腺和乳腺肿瘤来源的外泌体(Li等人，2018；Kwizera等人，2018年)。这些基于SERS的免疫分析由拉曼散射信号进行报告。此外，Jiang等人采用适配体/金纳米的新型传感器，基于比色法通过表面蛋白分析四种肿瘤来源的外泌体(Jiang等人，2017)。但是，上述方法存在灵敏度较差的问题。

近年来，非小细胞肺癌(NSCLC)相关外泌体的高灵敏、高特异检测新策略、新方法在不断研究中。有研究报道已开发出微流控芯片法而分离和分析NSCLC细胞中的外泌体，通过该方法能够评估外泌体的表型和磷酸化水平(He et al.，2014)。此外，Yu等人基于CD63特异性适配体设计了荧光团标记的磁珠，以确定来自NSCLC细胞的外泌体浓度(Yu等人，2019)。上述两种方法能够检测到低至1.0-10⁵粒子/μL的外泌体。然而，上述两种方法分析NSCLC来源的外泌体的过程较为复杂，需要荧光标记。

因此，发展出一种高灵敏度、免标记和高通量筛选NSCLC来源的外泌体的新型检测方法是非常重要的。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供基于表面等离子共振成像检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法及其应用，通过SPRi生物传感平台确定NSCLC来源的外泌体的群体和亚型，在临床应用中具有高灵敏度、免标记和多组分检测的优势。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于表面等离子共振成像(SPRi)检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的方法，包括如下步骤：

将外泌体表面蛋白的特异性抗体与金纳米进行连接与修饰，制备得到抗体修饰的功能化金纳米(AuNPs)；

将非小细胞肺癌细胞外泌体注入双通道流动池中，与修饰非小细胞肺癌相关蛋白特异性抗体的SPRi芯片靶向识别与结合；随后加入抗体修饰的功能化金纳米，再特异性结合SPRi芯片上吸附的外泌体，在芯片表面形成特异性抗体/外泌体/金纳米的“三明治”结构，通过SPRi检测非小细胞肺癌外泌体表面蛋白的表达差异性。

进一步，所述外泌体表面蛋白为CD63和/或CD81。

进一步，所述外泌体表面蛋白的特异性抗体选自anti-CD63、anti-EpCAM和anti-EGFR中的任意一种，优选为anti-CD63。

进一步，所述非小细胞肺癌细胞选自A549、H460和H1299中的任意一种。