[发明专利]一种仔猪肠道组织体外培养方法

说明书

本发明属于生物科技领域，公开了一种仔猪肠道组织体外培养方法，所述方法具体为：将仔猪肠道组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；所述培养基的组分为：Neurobasal A 培养基；100X规格的Penicillin Streptomycin solution 1倍体积；100X规格的N2 1倍体积；100X规格的B27‑supplement 5倍体积；50ng/ml EGF；10μM Y27632；0.5μM LY2157299；10μM CHIR99021；10mM HEPES；1mM N‑acetylcysteine；1x Glutamax。通过本发明的方法，可成功实现仔猪肠道组织体外培养。

技术领域

本发明涉及生物科技领域，尤其涉及一种仔猪肠道组织体外培养方法。

背景技术

早期断奶仔猪肠道等器官尚未发育成熟，导致其消化能力和抗逆能力较差，加上心理、营养与环境的突然转变，断奶仔猪表现为采食量下降、消化功能紊乱、腹泻、生长受阻等为主要特征的“早期断奶综合症”，给生猪养殖业带来重大经济损失，成为制约生猪规模化养殖的关键问题之一。同时肠道是动物机体重要的消化器官，也是机体抵御病原体入侵的第一道防线。仔猪肠道健康表现在肠道黏膜结构和功能正常，而各种应激会导致肠道黏膜和功能受损。在应激反应中动物机体为保证心、脑重要器官血液供应，通过复杂的神经-内分泌系统介导，调节全身血流重新分配，产生选择性内脏血管痉挛，如肠道缺血、缺氧等，进一步引起肠黏膜屏障受损、肠道细菌、内毒素群移位、炎性反应及多种细胞因子表达升高。因此探究仔猪肠道健康及营养调控是是动物营养学研究的热点问题之一。

目前针对仔猪肠道的研究主要是集中在2D细胞培养法（即单层细胞培养法）和3D类器官的技术培养法。2D细胞培养法主要是集中在对猪肠上皮细胞（IPEC-1和IPEC-J2），巨噬细胞等，这种方法能有效地进行定量分析、特征鉴定和标本复制等，能有效地研究细胞的信号通路，然而却不能准确反应动物体内的环境，也不能体现原始器官或者组织中细胞与细胞之间、细胞与基质之间很多复杂的生理反应，如受体表达、转录因子表达、细胞迁移和凋亡等；3D类器官技术主要是针对分离小肠隐窝或者小肠干细胞进行模拟的微型肠道（mini-gut），3D 培养技术能更好地模拟体内的微环境，更好的体现细胞的极化形态，以及细胞间、细胞与基质间的相互作用，需要借助matrigel等物质进行组织支架构建，缺失了原有形态，有些细胞如神经细胞缺失。本发明是直接通过从机体采取仔猪小肠组织，在培养板上直接进行培养，保持了组织中的细胞和其空间结构形态，能更加真实的反应机体内的情况，维持着小肠组织内的微环境结构。然而目前尚未见到仔猪肠道组织体外培养模型的构建和验证的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于：本发明首先提供一种采取仔猪肠道制备体外组织培养样本的技术。本发明通过从屠宰的仔猪中获得小肠组织，通过所述的方法，利用琼脂及切片技术制备用于小肠组织培养的切片。本发明不仅可以确保培养过程中的污染情况，同时也可以到达进一步研究的可能性模型。

本发明的另一个目的在于提供一种制备仔猪肠道组织体外培养的培养体系的方法。通过所述方法可以体外培养仔猪肠道组织。该方法可以在直接体外培养肠道组织，更加模拟体内环境，培养的肠道组织中含有大量的原有细胞，保持体内的微环境。本发明不仅可以为研究大型哺乳动物腹泻及肠道健康等提供了模型，也可以为机体天然免疫和炎症反应提供模型，还可以为深入探究营养素或相关基因在中发挥的调控作用提供研究工具。

本发明不作特殊说明的情况下：nM代表纳摩尔/升，μM代表微摩尔/升，mM代表毫摩尔/升，M代表摩尔/升；

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种仔猪肠道组织体外培养方法，所述方法具体为：将仔猪肠道组织切片后置于上凝固胶、下凝固胶之间，下凝固胶和培养基接触；每2～4天换一次培养基或者培养基变黄即更换；

所述培养基的组分为：