[发明专利]杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用，属于分子克隆领域。本发明工程藻通过在杜氏盐藻导入苹果酸酶基因ME1和ME2中的至少一种得到；其中，所述的ME1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ME2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明构建的苹果酸酶ME1过表达的工程藻ME1OE，油脂含量较野生藻提高了30.49％；苹果酸酶ME2过表达的工程藻ME2OE油脂含量提高了36.32％。本发明证明了结果表明过表达苹果酸酶可显著增加原始盐藻细胞中油脂含量，可在实际生产中进行应用。

本发明属于分子克隆领域，具体涉及杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用。

背景技术

由于对燃烧化石燃料引起的全球变暖的担忧和化石燃料资源的耗竭性，生物燃料作为一种极具吸引力的燃料在理论上具有巨大的优势和潜能。

微藻可以提供多种不同类型的可再生生物燃料，并且具有很强的适应性和生长速度，然而在自然状态下培养的微藻油脂产率普遍较低。因此利用基因工程技术构建高产油的工程微藻对于微藻的大规模应用和降低生物柴油的生产成本具有重要意义。

在脂质代谢中，苹果酸酶(malicenzyme,ME)起着重要作用。其能够与辅酶相结合，催化苹果酸发生氧化反应，进而脱羧，得到PA以及CO₂这两类产物，同时还会产生NAD(P)H。鉴于底物特异性以及辅酶专一性方面的区别，可把ME划分成下述3个类型：①NAD-ME(EC1.1.1.38)。此类型能够催化OAA发生脱羧反应；②NAD(P)+依赖型ME(EC1.1.1.39)。此类型可以利用NAD+，还可以利用NADP+，然更偏好于前者，无法催化OAA发生脱羧反应；③NADP-ME(EC1.1.1.40)。此类型也可以催化OAA发生脱羧反应。目前，已从多种产油微生物中克隆了苹果酸酶基因，证明了该酶在油脂积累过程中的关键作用。在产油微生物油脂合成过程中，通过人工调控苹果酸酶来调控碳流，提高苹果酸酶活性，为脂肪酸合成提供充足的还原力NADPH，从而调控油脂积累的增加。

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种可移动的单细胞无壁绿藻，可积累β-胡萝卜素，细胞大小约为6-14μm。它具有很高的耐盐性和耐光性并且具有较高的生长速率，目前已经商业化用于生产β-胡萝卜素。但野生盐藻的油脂产率并不能够达到商业化生产的目的，因此，构建一种稳定高产的产油脂的杜氏盐藻是一项具有重大意义的工作。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻。该工程藻以杜氏盐藻为材料，通过使苹果酸酶(ME)在重组藻细胞内过量表达，可实现杜氏盐藻油脂产量的增加。

本发明的另一目的在于提供通过上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻的构建方法。

本发明的再一目的在于提供通过上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻在生产油脂中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，所述的工程藻通过在杜氏盐藻导入苹果酸酶基因ME1和ME2中的至少一种得到；其中，所述的ME1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ME2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述的杜氏盐藻为杜氏盐藻CCAP 19/18。

进一步地，所述的苹果酸酶基因的导入通过同源重组技术实现；具体操作为：将含有苹果酸酶基因的重组质粒导入杜氏盐藻。

所述的重组质粒为以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbzdspro、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列ble-EGFP、杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dblycbter、杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbgapdhpro、杜氏盐藻苹果酸酶基因序列ME1或ME2、以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dbpsyter按转录方向依次连接在一起得到。