[发明专利]一种纯化含半胱氨酸多肽的方法

说明书

本发明涉及一种纯化含半胱氨酸多肽的方法，解决多肽纯化过程中产生易氧化形成二硫键或者二聚体等技术问题，本发明的技术方案为：一种纯化含半胱氨酸多肽的方法，包括以下步骤：将待纯化多肽产品溶解过滤后在色谱柱上进行分离，其中将多肽产品以包含还原剂的流动相进行洗脱，多肽产品以流动相A相和流动相B相进行洗脱分离，其中流动相A相为三氟乙酸水溶液，流动相A相中还包括还原剂。本发明可实现含半胱氨酸多肽规模纯化。

技术领域

本发明涉及一种多肽的纯化方法，特别涉及到一种纯化含半胱氨酸多肽的方法。

背景技术

通过化学合成的方法，人们不仅可以将20种天然氨基酸以外的非天然氨基酸插入序列的任意位置，而且能够实现特定位点的蛋白翻译后修饰。多肽的二硫键修饰中，分子内或者分子间一对二硫键的合成通常比较容易，反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H₂O₂，I₂，汞盐等激烈的反应条件。空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法， 空气氧化法通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（pH值6.5～10），反应24小时以上，形成目标二硫键。但是， 在含半胱氨酸多肽合成和制备过程中，在分子内或者分子间会形成非目标二硫键，也就是杂质，这样就增加了后续的纯化难度。 现有技术中，一般采用三种方法来进行制备纯化，以控制或者去除杂质，第一、通过控制粗品（或者纯化后的馏分）液体浓度来控制杂质，当上述液体浓度比较低时，溶液中的有效成分会与空气充分接触，容易被氧化，产生新的杂质；当浓度较高时，溶液中的有效成分会产生分子键成环，也会产生新的杂质；第二，采用多次纯化去除产生的非目标二硫键或者二聚体杂质，也就是通过对粗品的多次纯化，去除杂质；第三，在合成中采用选用带保护基团的半胱氨酸，将反应基团保护起来，如选择带TRT保护的半胱氨酸，即Cys（trt）、带Acm基团保护的半胱氨酸，即Cys（Acm）或者带CAM保护的半胱氨酸即Cys（CAM）等。

采用以上的三种手段，存在以下缺点：1、馏分液体没有固定的浓度，易产生新的杂质，不利于生产，无法控制质量；2、多次纯化，存在样品损耗大，收率低，而且耗时很长，不利于大规模生产；3、采用带保护的半胱氨酸，合成多肽粗品纯度低，并且由于带有保护基团，造成溶解性差不利于后期纯化以及放大生产。

本发明提供了一种纯化含半胱氨酸多肽的方法，可以克服的解决上述三种现有技术存在的缺点，纯度低、费时费力的缺点，操作方便同时大大提高收率和产品纯度，并且易于放大生产。

发明内容

本发明提供一种纯化含半胱氨酸多肽的方法。该方法可以有效解决多肽纯化过程中产生易氧化形成二硫键或者二聚体等技术问题，同时还可以保证收率和产品质量。

本发明的技术方案：一种纯化含半胱氨酸多肽的方法，包括以下步骤：将待纯化多肽产品溶解过滤后在色谱柱上进行分离，其中将多肽产品以包含还原剂的流动相进行洗脱。

优选的，所述流动相洗脱：将多肽产品以流动相A相和流动相B相进行洗脱分离，其中流动相A相为三氟乙酸水溶液，流动相A相中还包括还原剂。

更为优选的方案是：流动相A相中所述还原剂选自二硫代苏糖醇（DTT）、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP）或beta-巯基乙醇的一种；

更为优选的方案是：流动相A相中还原剂为二硫代苏糖醇（DTT）或者beta-巯基乙醇，且A相pH为6.5-9.0，优选pH为6.5。

更为优选的方案是：流动相A相中还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐（TCEP），且A相pH为1.5-8.5，优选pH为1.5-2.5。

更为优选的方案是：还原剂的摩尔浓度为1-100mM。

流动相A相为三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵中的一种。

流动相B相为甲醇、乙腈或乙醇的一种。