[发明专利]一种二氧化硫和黏度双识别荧光探针的设计方法

权利要求书

1.一种二氧化硫和黏度双识别荧光探针的设计方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：识别机理，氧杂蒽衍生物是常见的荧光染料之一，具有良好的光稳定性、高荧光量子产率、较长的荧光发射波长等优势，常被用作荧光探针设计中的信号发射团，探针SZD1是由氧杂蒽基团作为电子供体共轭连接一个拉电子的对氰基苯甲醛，探针分子中形成了推－拉－拉(D-π-A-π-A)强共轭体系，

S2：探针SZD1的合成路线；

化合物3的合成，化合物3根据文献合成，冰水浴下在40mL硫酸中加入化合物2(3mL)，搅拌下加入化合物1(2.50g)，氮气保护下90℃加热1.5h，将反应液倒入冰块后加入3.5mL高氯酸，析出红色固体，抽滤并用超纯水洗涤并干燥得到化合物3(1.98g)，

探针SZD1的合成，将化合物3(0.57g)在搅拌下加入含20mL冰醋酸的150mL的茄形瓶中，加入化合物4(0.13g)，120℃加热回流6h，冷却至室温，加入200mL超纯水搅拌，析出大量紫色固体，抽滤，使用硅胶柱层析法(二氯甲烷：石油醚＝2:1，V:V)分离提纯得到的固体，得到目标化合物0.26g，产率70％.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.58(s,1H),8.05(d,J＝2.2Hz,1H),7.96(t,J＝9.0Hz,3H),7.81–7.74(m,2H),7.55(dd,J＝9.5,2.4Hz,1H),7.33–7.29(m,1H),3.75(s,4H),2.95–2.88(m,4H),1.86(p,J＝6.2Hz,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ160.61,159.22,156.96,149.33,140.25,132.95,132.82,132.68,131.83,131.40,124.47,120.68,119.83,119.11,111.54,95.89,40.49,27.12,26.94,21.57,12.86.

S3：光谱测试方法及储备液的配置，将PBS溶液粉末使用蒸馏水溶解，转移到容量瓶后定容到2L，静置后，用pH计测量其pH为7.40密封待用；

准确称取1.48mg探针SZD1，溶于4mL CH₃CN中，震荡均匀配制成1mmol/L探针母液，密封冻存待用，

探针的测试浓度为1×10^－5mol/L，在37℃条件下进行探针的紫外吸收光谱测试，测试过程中用PBS缓冲溶液(1×10^－2mol/L，pH＝7.4，体积分数为10％的乙腈为助溶剂)作为测试溶液，待测物NaHSO₃的浓度范围为0～4×10^－5mol/L，测试选择性过程中所用检测化合物：硝酸银、L－精氨酸、天冬氨酸、氯化钙、次氯酸钠、硫酸铜、氟化钠、三氯化铁、甘氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、DL－同型半胱氨酸、组氨酸、碘化钾、亮氨酸、甲硫氨酸、氯化镁、硫化钠、氢氧化钠、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、硫酸钠、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化锌、亚硫酸氢钠、浓度均为1×10^－4mol/L，测试过程中用PBS溶液(1×10^－2mol/L，pH＝7.4，体积分数为10％的CH₃CN)作为测试溶液，在37℃的条件下进行荧光光谱测试，样品池的规格为1cm×1cm×4cm，550nm作为探针的激发波长，狭缝选择10nm，

S4：探针在丙三醇(Glycerol)-PBS中的荧光光谱测试，选择丙三醇－磷酸缓冲盐溶液(PBS)体系作为测试体系，首先配制具有不同比例的丙三醇－PBS溶液，其中丙三醇的比例由0增加至100％，得到黏度不同的丙三醇－PBS混合溶液，移取30μL探针储备液分别置于不同的4mLEP管中，分别加入上述配制好的具有不同粘度的混合溶液，使得测试体系总共3mL(探针的终浓度为1×10^－5mol/L)，涡旋5分钟，充分混合均匀，测定探针在不同粘度溶液中的荧光光谱，设置激发波长为550nm，

S5：探针的细胞毒性测试，将培养好的、细胞密度大于90％的HeLa细胞分于96孔板中，摇匀后向每个孔中加入0.1mL的细胞溶液，将细胞培养24h后，细胞贴壁，随后向每个孔中加入不同浓度的探针培养基溶液(0～2.×10^－6mol/L)，将其放入恒温培养箱中培养24h后，向每个孔中加入5×10^－2g/L的噻唑蓝(MTT)培养基溶液，又将其放回恒温培养箱中继续培养4h，有紫色晶体生成，将96孔板中的培养基移除，随后向每个孔中加入0.1mL的二甲基亚砜使紫色晶体溶解，最后用酶标仪在492nm下对其进行吸光度测试，根据以下公式可计算细胞的存活率：

细胞存活率(％)＝(OD_sample－OD_blank)/(OD_control－OD_blank)×100％

OD_sample表示在不同的孔板中加入不同浓度的探针XA-SO2孵育细胞所测量的结果，OD_blank表示空白培养基所测量的结果，OD_control表示培养基所测量的结果，

S6：小鼠孵育方法，本次实验小鼠购自广西医科大学，在小鼠活体成像实验中，先使用异氟烷麻醉小鼠，再向腹腔注射4％的水合氯醛150μL彻底麻醉小鼠，然后将100μL探针SZD1(0.2×10^-4mol/L)注入小鼠腹腔内孵育5min，作为对照组，

取一只小鼠体内注射探针SZD1溶液100μL(测试浓度为0.2×10^-4mol/L)；向第二只小鼠注射探针SZD1溶液50μL(测试浓度为2×10^-4mol/L)，再注射NaHSO₃溶液50μL(测试浓度为2×10^-3mol/L)；另取一只小鼠体内注射含有70％丙三醇作为溶剂的SZD1溶液100μL(测试浓度为2×10^-4mol/L)，作为实验组，

S7：探针SZD1的光谱性能测试；

S7.1：探针SZD1与SO₂作用的紫外吸收光谱滴定测试，首先测定探针SZD1在10％乙腈(CH₃CN)磷酸缓冲溶液(PBS)中的紫外吸收光谱，探针SZD1测试浓度为1×10^-5mol/L，紫外可见吸收光谱结果显示探针SZD1在500-600nm内有强烈的吸收峰，并在550nm处有最大吸收峰，计算得出探针SZD1的摩尔吸光系数ε为4×10⁶L/(mol·cm)，随着加入NaHSO₃浓度的升高550nm处的吸收峰逐渐降低，肉眼可见探针溶液的颜色从深紫色变为浅紫色直到无色透明，证明SO₂与探针发生了加成反应导致探针的共轭体系被破坏；

S7.2：探针SZD1与SO₂作用的荧光光谱滴定测试，根据紫外可见吸收光谱的测试结果，选择最大吸收峰处的波长550nm作为激发波长进行探针荧光光谱的测试，

根据荧光光谱的测试结果，探针在680nm处有属于长共轭体系结构的强烈荧光发射，与紫外可见吸收光谱的结果一致，在体系中加入NaHSO₃溶液后680nm处的荧光开始降低，随着体系中加入的NaHSO₃浓度的升高，探针在680nm处的荧光发射逐渐降低，当NaHSO₃浓度达到4×10^-5mol/L时荧光强度趋于稳定，荧光波长变短小于可见光吸收区域，实验结果与紫外吸收光谱的滴定结果一致，NaHSO₃的浓度为4×10^-5mol/L时荧光强度降低达到极限，此时的探针在680nm处的荧光强度与未加入NaHSO₃时的荧光强度相比降低了约17倍；

S7.3：探针SZD1响应粘度的荧光光谱测试，为了研究探针SZD1对粘度的响应趋势，选择丙三醇(Glycerol)作为粘度介质按照不同比例加入PBS(10％CH₃CN)缓冲液中测定探针SZD1的荧光发射光谱；

S7.4：探针SZD1响应SO₂的机理研究，采用高分辨质谱来验证探针SZD1对SO₂的响应机制，将探针SZD1与NaHSO₃反应后通过HR-MS进行分析；

S7.5：探针SZD1的动力学测试，为了研究探针SZD1对SO₂的响应快慢，我们使用三种不同浓度的NaHSO₃溶液(0、1.6×10^-5mol/L、4×10^-5mol/L)进行了动力学测试；

S7.6：探针SZD1在不同pH下的识别效应研究，在pH范围4.4-10条件下测试了探针对SO₂和粘度的响应能力；

S7.7：探针SZD1的选择性研究，

能够在复杂环境中也对识别物具有高选择性是荧光探针设计的初衷之一，为了检测生物体内的各类离子和化合物是否会影响探针SZD1对SO₂和粘度的响应，我们进行了干扰实验，选择生物体内具有代表性的无机盐、氨基酸、过氧化物加入体系中进行研究；

S7.8：探针SZD1的细胞毒性研究，

为了探究探针SZD1是否具有较低的生物毒性和较好的生物相容性，使用了噻唑蓝(MTT)法测试了不同浓度(0～2.5×10^－6mol/L)的探针SZD1对HeLa细胞的毒性，

S7.9：探针SZD1的小鼠成像研究，为了探究探针SZD1的生物成像能力，在小鼠体内进行了成像实验，选择三只小鼠，首先向其中一只小鼠体内注射探针SZD1溶液100μL(测试浓度为0.2×10^-4mol/L)；向第二只小鼠注射探针SZD1溶液50μL(测试浓度为2×10^-4mol/L)，再注射NaHSO₃溶液50μL(测试浓度为2×10^-3mol/L)；最后向第三只小鼠体内注射含有70％丙三醇作为溶剂的SZD1溶液100μL(测试浓度为2×10^-4mol/L)，然后对三只小鼠进行了活体成像实验。