[发明专利]一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的免疫荧光试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的免疫荧光试剂盒，包括A液、B液、C液和D液，其特征在于：所述A液包括有多聚甲醛，所述B液包括有牛血清白蛋白和曲拉通X-100，所述C液包括有牛血清白蛋白、曲拉通X-100、抗细胞角蛋白荧光抗体、抗HER-2荧光抗体，所述D液包括有抗荧光淬灭封片液。

2.根据权利要求1所述的还包括一种检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法包括以下步骤：S1、循环肿瘤细胞富集；S2、制备细胞载玻片样本；S3、多色免疫荧光染色；S4、荧光显微镜镜检观察和记录和S5、结果分析，其中：

S1、循环肿瘤细胞富集：取人抗凝外周血4-6mL，采用CTCs富集方法富集回收CTCs；

S2、制备细胞载玻片样本：将步骤S1获得的CTCs细胞固定于吸附载玻片上，获得细胞载玻片样本；

S3、多色免疫荧光染色：包括a、细胞固定；b、细胞通透与封闭；c、细胞染色和d、荧光抗淬灭剂封片，其中：

a、细胞固定：吸取A液40μL，滴加到整个标本区，室温静置10min，然后吸弃A液，吸取滴加40μL 1×PBS，洗涤标本区；

b、细胞通透与封闭：吸取B液40μL，滴加到整个标本区，于湿盒内在室温放置1hr，然后吸弃B液，吸取滴加40μL 1×PBS，洗涤标本区；

c、细胞染色：吸取C液40μL，滴加到整个标本区，于湿盒内在室温放置1hr，然后吸弃C液，吸取滴加40μL 1×PBS，洗涤标本区；

d、荧光抗淬灭剂封片：吸取D液，滴加到整个标本区，盖上盖玻片；

S4、荧光显微镜镜检观察和记录：采用荧光显微镜进行观察并计数所有的红色荧光细胞数，通过荧光显微镜将全区域进行拍照记录，再进行CTCs计数，同时可根据平均荧光强度记录HER-2表达强弱；

S5、结果分析：通过对比红光(CK)、绿光(HER-2)和蓝光(细胞核)共同出现的位置，可将染色的细胞归类为HER-2阳性或HER-2阴性循环肿瘤细胞，或血液有核细胞，同时显色红色、绿色和蓝色的细胞为HER-2阳性循环肿瘤细胞，同时显色红色和蓝色的细胞为HER-2阴性循环肿瘤细胞，仅显色蓝色的细胞为血液有核细胞，根据平均荧光强度，区分HER-2的高、中、低表达水平。

3.根据权利要求1所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述D液的抗荧光淬灭封片液中含有Hoechst 33342。

4.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤S2中CTCs细胞固定于吸附载玻片的方法包括细胞涂片和甩片(细胞离心涂片仪)中的任意一种。

5.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤S3中进行步骤a、细胞固定前先将待测样本及试剂盒，室温静置15-30min，复温至室温，用免疫组化笔在载玻片上的细胞周围画圈，防止液体扩散。

6.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤a、b、c中滴加PBS完成后静置3到5min，再重复洗涤操作2到3次。

7.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤d中吸取D液的量为18μL和38μL中任意一种，吸取量为18μL采用20mm×20mm规格的盖玻片，吸取量为38μL采用24mm×24mm规格的盖玻片，并且保证盖上盖玻片时无气泡。

8.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：所述荧光显微镜包括DAPI、FITC和Tex Red三种荧光滤色模块，同时采用正置荧光显微镜将全区域进行自动化拍照记录。

9.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤c到步骤S4操作过程中均需避光。

10.根据权利要求2所述的检测肿瘤细胞表面标志分子HER-2的方法，其特征在于：本方法步骤d中盖上盖玻片后在盖玻片周边滴加封片剂进行固定，所述封片剂包括指甲油、中性树胶、中性快干胶和甘油中的任意一种。