[发明专利]一种由精液介导的转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法

说明书

本发明公开了一种由精液介导的转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，包括以下步骤：设计靶向鸡基因组DNA的gRNA：选用鸡基因组目标DNA序列为卵清蛋白，选择同源性90％以上的gRNA；构建gRNA的表达载体；构建携带有外源基因表达框的供体载体，将供体载体转变为ssDNA；将载体通过精子载体法人工授精导入鸡个体；本发明将CRISPR基因编辑技术和精子载体法两种技术有机结合，弥补制备转基因动物时精子载体法外源DNA整合困难的缺陷，提高外源基因整合到基因组中的准确率，实现高效率导入外源基因，制备出能够表达并分泌外源蛋白到鸡蛋蛋清中的转基因鸡，使外源基因稳定遗传，且成本低廉，对卵原核无损伤。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种由精液介导的转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法。

背景技术

转基因动物生物反应器的出现克服了细菌基因工程产物的缺陷和细胞基因工程生产规模的限制，从而受到人们极大的关注。家禽具有周期短、生产性能高、研究成本低，而且表达产物更接近天然状态和易于纯化等优点。1993年英国罗斯林研究所Sang研究禽类蛋黄表达系统，在禽蛋卵黄成功表达外源蛋白，但含量不高。1994年曾邦哲(曾杰)最早提出了禽类转基因输卵管生物反应器(oviduct bioreactor)的概念(以及术语和词汇)，并在1996年北京召开的第1届国际转基因动物学术研讨会上阐述了系统(结构)遗传学方法与转基因生物技术研究。在此期间，中国曾邦哲与加拿大、美国、英国、日本有关转基因禽类实验室和禽类开发的企业联系，但国际上当时没有人开展这项课题。美国Avigenics公司和Georgia大学R.Ivarie教授与曾邦哲(曾杰)展开了通信探讨研究后独自开展了立项和规模化投资与开发。目前，国际上有十多家前景看好的公司以转基因输卵管生物反应器作为拳头开发产品，约2003年英国罗斯林研究所也创建了公司，并由Sang主持研究课题，从禽类蛋黄表达系统转向了输卵管生物反应器。转基因输卵管生物反应器，采用蛋清蛋白质基因的侧翼特异表达调控序列、启动子和多肽分泌信号序列，构建在禽类输卵管细胞特异性表达外源贵重蛋白质的转基因生物反应器，蛋清蛋白质在输卵管细胞表达、含量比较高、蛋白质修饰质量好。输卵管生物反应器(Oviduct Bioreactor)成为继哺乳动物乳腺生物反应器后最具发展前景的动物生物反应器。

生产转基因鸡的方法可以通过显微注射，将外源基因直接注射到单细胞受精卵细胞质中，经过体外培养后，产生转基因鸡。但是，此种方法取到一个受精卵需要一只母鸡，若操作失败，一个细胞的损失就相当于一只母鸡的损失，成本较高，并且受精卵体外孵化条件也很复杂，操作难度较大。在国内，李赞东等将脂质体包装后的质粒pMiwz(含有报告基因LacZ)注入囊胚期胚盘中，转基因获得成功，并证明囊胚期注射外源基因可以获得转染的原生殖细胞(PGCs)，并能够传给下一代。Jamie love等将带有目的基因质粒DNA注射入鸡受精卵的胚胎中，体外培养12h后发现近一半存活，40％胚胎中含有质粒DNA，有6％相当于每一个细胞含有1个拷贝的外源基因，7只存活至性成熟雏鸡中的一只将3.4％外源基因传递给其后代。此种方法可以得到转基因嵌合体鸡，但转基因细胞的嵌合部位和嵌合程度不容易确定。逆转录病毒载体利用重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度的病毒颗粒，将此病毒颗粒注射到囊胚腔内或将去除透明带的胚胎与分泌病毒的细胞共培养，使携带外源基因的反转录病毒RNA在感染过程中整合到宿主细胞的染色体内，达到外源基因转移到胚胎的目的病毒正常生命周期特征来感染家禽，从而导入外源并达到整合的目的。使用的病毒载体有两类：复制完全型和复制缺陷型(高波，2000)。复制完全型逆转录病毒包含全部结构基因能自我复制，并能重复感染细胞。而复制缺陷型逆转录病毒缺乏部分或全部结构基因，不能自我复制，需在辅助细胞中繁殖。反转录载体法的整合效率比电穿孔和脂质体转染法要高，但是由于基因片段大小的限制和获得高滴度病毒有困难，所以主要停留在实验室阶段，还未广泛应用于商业生产(刘向萍，2003)。