[发明专利]猪NONO蛋白敲除基因、相关质粒、细胞系及制备方法和应用

权利要求书

1.猪NONO蛋白敲除基因，其特征在于核苷酸序列见序列表中序列2的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的猪NONO蛋白敲除基因，其特征在于与NONO蛋白核苷酸序列相比，450-966 bp间碱基缺失。

3.一种猪NONO蛋白敲除基因相关质粒，含有序列表中序列1的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的猪NONO蛋白敲除基因相关质粒，其特征在于在Px459M质粒的Hind III酶切位点以及距离Hind III酶切位点最远的Bbs I酶切位点之间插入的核苷酸序列见序列表中序列1的核苷酸序列。

5.一种猪NONO蛋白敲除基因相关质粒的制备方法，其特征在于是通过以下步骤得到的：

（1）设计两对引物，核苷酸序列如下：

sNONO-KO-3Fwd: 5’-CACCAGGAAGGTTTCGGACCGTAA-3’，

sNONO-KO-3Rev: 5’-AAACTTACGGTCCGAAACCTTCCT-3’，

sNONO-KO-4Fwd: 5’-CACCGGCGTCAAGAAGAACTTCGG-3’，

sNONO-KO-4Rev: 5’-AAACCCGAAGTTCTTCTTGACGCC-3’，

将引物sNONO-KO-3Fwd和sNONO-KO-3Rev进行磷酸化和退火，得到sNONO-KO-3P， 将引物sNONO-KO-4Fwd和sNONO-KO-4Rev进行磷酸化和退火，得到sNONO-KO-4P；

（2）构建基因敲除质粒

使用BbsI酶切质粒Px459M和EZ-Guide-XH，分别胶回收，得到载体片段1和载体片段2，将sNONO-KO-3P连接到载体片段1，得到Px459M-sNONO-KO-3P，将sNONO-KO-4P连接到载体片段2，得到EZ-Guide-XH-sNONO-KO-4P，用Hind III/XhoI分别双酶切Px459M-sNONO-KO-3P和EZ-Guide-XH-sNONO-KO-4P，得到载体片段3和基因片段4，将载体片段3和基因片段4连接，得到猪NONO蛋白敲除基因相关质粒Px459M-sNONO-KO。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于磷酸化和退火操作如下：反应体系中含sNONO-KO-3Fwd和sNONO-KO-3Rev或sNONO-KO-4Fwd和sNONO-KO-4Rev各10 µmoL/L，10×T4ligase buffer 1 µL，T4 PNK 1 U，H₂O 6 µL，共10 µL；反应条件为：37 ℃ 30 min，95 ℃5 min，PCR梯度降温至25 ℃，速度为每秒降低0.1 ℃，25 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

7.一种猪NONO蛋白敲除基因相关细胞系，权利要求5或6所述的猪NONO蛋白敲除基因相关质粒转染PAM-KNU细胞，使用含有嘌呤霉素培养基筛选，存活的抗性细胞克隆即为猪NONO蛋白敲除基因相关细胞系。

8.一种权利要求1或2所述的猪NONO蛋白敲除基因、权利要求3或4所述的猪NONO蛋白敲除基因相关质粒、权利要求7所述的猪NONO蛋白敲除基因相关细胞系在制备疫苗中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述猪NONO蛋白敲除基因相关细胞系感染PRV后，抑制IFN-β mRNA表达。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述细胞系促进PRV增殖。