[发明专利]一种多能干细胞诱导产生3D类脑体的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种制备3D类脑体的方法，包括：

1)将多能干细胞在培养基I中进行培养，得到培养基I培养后的组织；

所述培养基I由向DMEM/F12培养基中添加KnockOut^TMSerum Replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、Y-27632、dorsomorphin和SB431542得到；其中，KnockOut^TMSerumReplacement在所述培养基I中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在所述培养基I中的含量为1mM；2-巯基乙醇在所述培养基I中的含量为0.1mM；Y-27632在所述培养基I中的含量为20μM；dorsomorphin在所述培养基I中的含量为5μM，SB431542在所述培养基I中的含量为5μM；

2)将所述培养基I培养后的组织在培养基II中进行培养，得到培养基II培养后的组织；

所述培养基II由向DMEM/F12培养基中添加KnockOut^TMSerum Replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、Y-27632、dorsomorphin和SB431542得到；其中，KnockOut^TMSerumReplacement在所述培养基II中的体积百分含量为20％；非必需氨基酸在所述培养基II中的含量为1mM；2-巯基乙醇在所述培养基II中的含量为0.1mM；Y-27632在所述培养基I中的含量为5μM；dorsomorphin在所述培养基II中的含量为5μM；SB431542在所述培养基II中的含量为5μM；

3)将所述培养基II培养后的组织在培养基III中进行培养，得到培养基III培养后的组织；

所述培养基III由向neurobasalA培养基中添加GlutaMAX添加剂、B27添加剂withoutvitamin A、表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2得到；其中，GlutaMAX添加剂在所述培养基III中的体积百分含量为1％，B27添加剂without vitamin A在所述培养基III中的体积百分含量为2％，表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2在所述培养基III中的含量均为20ng/ml；

4)将所述培养基III培养后的组织在培养基IV中进行培养，得到培养基IV培养后的组织；

所述培养基IV由向neurobasal A培养基中添加GlutaMAX添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，GlutaMAX添加剂在所述培养基IV中的体积百分含量为1％，脑源性神经营养因子在所述培养基IV中的含量为20ng/ml；神经营养因子3在所述培养基IV中的含量为20ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基IV中的含量为20ng/ml；

5)将所述培养基IV培养后的组织在培养基V中进行培养，得到3D类脑体；

所述培养基V由向neurobasal A培养基中添加GlutaMAX添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到；其中，GlutaMAX添加剂在所述培养基V中的体积百分含量为1％，脑源性神经营养因子在所述培养基V中的含量为10ng/ml；神经营养因子3在所述培养基V中的含量为10ng/ml；胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基V中的含量为10ng/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，在所述培养基I培养前，还包括对所述干细胞进行消化的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)-5)中培养均在37℃，5％CO₂的条件下进行。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)中培养的时间为2天；

和/或，步骤2)中培养的时间为4天；

和/或，步骤3)中培养的时间为19天；

和/或，步骤4)中培养的时间为18天。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述多能干细胞为诱导性多能干细胞、成体干细胞、体性干细胞、癌症干细胞或具有分化能力的任何其他多能干细胞。