[发明专利]一种多能干细胞诱导产生3D类脑体的方法及试剂盒在审
申请号: | 202210640860.6 | 申请日: | 2022-06-08 |
公开(公告)号: | CN114958746A | 公开(公告)日: | 2022-08-30 |
发明(设计)人: | 刘长梅;徐雅洁;滕兆乾;刘佩佩;杜洪震 | 申请(专利权)人: | 中国科学院动物研究所 |
主分类号: | C12N5/079 | 分类号: | C12N5/079;C12N5/071 |
代理公司: | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人: | 魏少伟 |
地址: | 100101 北*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 多能 干细胞 诱导 产生 类脑体 方法 试剂盒 | ||
1.一种制备3D类脑体的方法,包括:
1)将多能干细胞在培养基I中进行培养,得到培养基I培养后的组织;
所述培养基I由向DMEM/F12培养基中添加KnockOutTMSerum Replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、Y-27632、dorsomorphin和SB431542得到;其中,KnockOutTMSerumReplacement在所述培养基I中的体积百分含量为20%;非必需氨基酸在所述培养基I中的含量为1mM;2-巯基乙醇在所述培养基I中的含量为0.1mM;Y-27632在所述培养基I中的含量为20μM;dorsomorphin在所述培养基I中的含量为5μM,SB431542在所述培养基I中的含量为5μM;
2)将所述培养基I培养后的组织在培养基II中进行培养,得到培养基II培养后的组织;
所述培养基II由向DMEM/F12培养基中添加KnockOutTMSerum Replacement、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、Y-27632、dorsomorphin和SB431542得到;其中,KnockOutTMSerumReplacement在所述培养基II中的体积百分含量为20%;非必需氨基酸在所述培养基II中的含量为1mM;2-巯基乙醇在所述培养基II中的含量为0.1mM;Y-27632在所述培养基I中的含量为5μM;dorsomorphin在所述培养基II中的含量为5μM;SB431542在所述培养基II中的含量为5μM;
3)将所述培养基II培养后的组织在培养基III中进行培养,得到培养基III培养后的组织;
所述培养基III由向neurobasalA培养基中添加GlutaMAX添加剂、B27添加剂withoutvitamin A、表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2得到;其中,GlutaMAX添加剂在所述培养基III中的体积百分含量为1%,B27添加剂without vitamin A在所述培养基III中的体积百分含量为2%,表皮细胞生长因子及人成纤维细胞生长因子-2在所述培养基III中的含量均为20ng/ml;
4)将所述培养基III培养后的组织在培养基IV中进行培养,得到培养基IV培养后的组织;
所述培养基IV由向neurobasal A培养基中添加GlutaMAX添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到;其中,GlutaMAX添加剂在所述培养基IV中的体积百分含量为1%,脑源性神经营养因子在所述培养基IV中的含量为20ng/ml;神经营养因子3在所述培养基IV中的含量为20ng/ml;胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基IV中的含量为20ng/ml;
5)将所述培养基IV培养后的组织在培养基V中进行培养,得到3D类脑体;
所述培养基V由向neurobasal A培养基中添加GlutaMAX添加剂、脑源性神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源性神经营养因子得到;其中,GlutaMAX添加剂在所述培养基V中的体积百分含量为1%,脑源性神经营养因子在所述培养基V中的含量为10ng/ml;神经营养因子3在所述培养基V中的含量为10ng/ml;胶质细胞源性神经营养因子在所述培养基V中的含量为10ng/ml。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中,在所述培养基I培养前,还包括对所述干细胞进行消化的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤1)-5)中培养均在37℃,5%CO2的条件下进行。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:步骤1)中培养的时间为2天;
和/或,步骤2)中培养的时间为4天;
和/或,步骤3)中培养的时间为19天;
和/或,步骤4)中培养的时间为18天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述多能干细胞为诱导性多能干细胞、成体干细胞、体性干细胞、癌症干细胞或具有分化能力的任何其他多能干细胞。
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