[发明专利]一种苦荞的遗传转化方法

权利要求书

1.一种苦荞的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌苗的制备：将灭菌的苦荞种子接种至MS培养基中进行培养，得到无菌苗；

(2)农杆菌的培养：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，得到农杆菌侵染液；

(3)外植体制备：将所述无菌苗用无菌刀片在子叶连接处向下2-5mm处平切，去除下胚轴区域及真叶部分，得到子叶节外植体；

(4)侵染与共培养：将所述子叶节外植体放入所述农杆菌侵染液中浸染，将侵染后的外植体吸干水分，放入共培养培养基中暗培养，得到共培养子叶节外植体；

(5)不定芽诱导培养：将所述共培养子叶节外植体接种至不定芽诱导培养基上培养，得到继代培养丛芽；

(6)生根培养：将所述继代培养丛芽分成单株，接种至生根培养基中培养，得到苦荞转基因植株。

步骤(5)中，所述不定芽诱导培养基的组分包括蔗糖25-35g/L、MS粉4-5g/L、琼脂粉6-8g/L、6-苄氨基嘌呤1mg/L；调节所述不定芽诱导培养基的pH为5.6-6.0，所述培养的条件为20-25℃，光照强度5000-6000lx，光照14-16h/d，培养15-25d。

2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述MS培养基的成分为：蔗糖25-35g/L、MS粉4-5g/L、琼脂粉6-8g/L；调节所述MS培养基的pH值为5.6-6.0，所述培养的条件为20-25℃、光照强度5000-6000lx、光照14-16h/d，时间10-15d。

3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述灭菌的具体方法为将苦荞种子依次用70％酒精浸泡30s、无菌水清洗2-3次、0.1％升汞消毒8min、无菌水清洗6-8次，然后去除表面水分。

4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述农杆菌为LBA4404；所述农杆菌载体为pCHF3-YFP；所述农杆菌活化培养基的组分包括牛肉膏4-6g/L、蛋白胨4-6g/L、酵母膏0.5-2g/L、蔗糖4-6g/L、七水硫酸镁0.2-0.8g/L，调节所述农杆菌活化培养基的pH值为7.0-7.5。

5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述农杆菌制备成农杆菌菌液后接种于农杆菌活化培养基上活化，所述农杆菌菌液的OD 600 为0.4-0.6。

6.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)中，所述共培养培养基的组分包括蔗糖25-35g/L、MS粉4-5g/L、琼脂粉6-8g/L、乙酰丁香酮180-220mg/L；调节所述共培养培养基pH值为5.6-6.0，所述培养的条件为20-22℃下暗培养2-3d。

7.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：所述不定芽诱导培养基的组分还包括卡那霉素40-60mg/L、特美汀40-60mg/L。

8.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(5)中，在不定芽诱导培养基上期间，每隔14-16天继代培养一次。

9.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)中，所述生根培养基的组分包括蔗糖25-35g/L、MS粉4-5g/L、琼脂粉6-8g/L、吲哚丁酸1-2mg/L；调节所述生根培养基的pH＝5.6-6.0，所述培养的条件为20-25℃，光照强度5000-6000lx，光照14-16h/d，培养15-25d。