[发明专利]一种用于检测microRNA的阴极光电传感器的制备方法

权利要求书

1.一种基于p-n异质结猝灭模式和CRISPR/Cas12a反切活性的阴极光电化学生物传感器检测microRNA的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）染料[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺PF₆⁻敏化NiO电极的制备

所述染料[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺PF₆⁻（其中C6为香豆素-6，dcbpy为2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸）的结构式为：

将面积固定的的ITO电极在真空条件下干燥后放入含有六水合硝酸镍和六亚甲基四胺的离心管中，离心管置于烘箱中90 ℃加热1小时，在空气中冷却至室温后，再置于马弗炉300 ℃下焙烧30分钟，得到镀有氧化镍薄膜的电极。然后将电极浸泡到[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺PF₆⁻的DMF（50 µM，400 μL）溶液中12个小时，使[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺PF₆⁻组装到纳米NiO薄膜上，然后用DMF和CH₃CN依次冲洗两次。随后在N₂气流中干燥后获得[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺/NiO/ITO光电极；

（2）DNA₁-Bi₂S₃量子点修饰的光电传感器制备

将Bi₂S₃量子点进行活化后与DNA₁混合，放置在摇床中搅拌过夜。然后加入BSA以去除非特异性位点随后将所得溶液进行离心处理。在步骤（2）中制备的[(C6)₂Ir(dcbpy)]⁺/NiO/ITO电极上加入含有乙酸的壳聚糖溶液，于50 ℃下干燥40分钟，然后用NaOH溶液和超纯水清洗2次。随后将戊二醛溶液滴加到所制备的电极上，于室温下反应30分钟后加入DNA₂并在37 ℃下孵育1小时，将制备的DNA₁-Bi₂S₃ QDs混合液滴加在修饰过的电极上，最后，用PBS溶液冲洗后，组装电极；

所述DNA₁的序列为：5’-TTTTTTACAAGGGCTAGG-3’（5’端标记-NH₂）；

所述DNA₂的序列为：5’-CCTAGCCCTTGT-3’（5’端标记-NH₂）；

（3）miRNA的检测

目标microRNA（10 μL，1 μM）和H₁（10 μL，2 μM）置于摇床中37℃旋转两小时，加入CRISPR/Cas12a酶（10 μL，50 nM）和crRNA（10 μL，40 nM）反应30分钟。然后取20 μL滴加到步骤（2）制备的电极上，进行CRISPR/Cas12a酶介导的DNA反式裂解实验并于37 °C孵育1小时，然后使用PBS缓冲液冲洗后进行光电检测；

所述H₁的序列为：5’-CAAACACCATTGTCACACTCCATTCCCATGAGTGTGACAATTT-3’

所述crRNA的序列为：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAUUGUCACACUCCCUC-3’。

2.根据权利要求1所述的阴极光电化学生物传感器检测在检测microRNA中的应用。