[发明专利]一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法

权利要求书

1.一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：选取三种伞形科蔬菜：芹菜、香菜和胡萝卜以及拟南芥的基因组数据进行LCY基因家族鉴定和分析；

步骤二：分析LCY基因家族的染色体定位、共线性关系、保守基序和启动子区的顺势作用元件，使用MCScanX软件对三个伞形科基因组进行共线性分析，提取含有LCY基因的同源基因对，使用TBtools软件进行可视化展示，并对LCY基因家族进行内含子、外显子结构分析，使用MEME网站对LCY基因家族进行保守基序的鉴定，将基序最大搜寻数量设置为20，其他的参数默认，使用TBtools提取LCY基因上游1500bp区域，利用PlantCARE软件鉴定LCY基因启动子区域顺式作用原件；

步骤三：对芹菜、香菜、胡萝下和拟南芥的LCY基因进行了多序列比对和系统发育分析，首先，利用ClustalW2进行多序列比对，然后使用IQTREE软件的模型搜索功能确定最佳模型，利用Evolview网站对进化树进行可视化展示；

步骤四：对三种蔬菜的选择压力进行计算分析，计算非用义替换Ka和同义替换Ks；

步骤五：以津南实芹为实验材料，对津南实芹进行培养，培养至60d时，选取长势一致的健康植株，分组进行不同逆境条件处理，高、低温处理通过将生长室温度分别调整为38℃和4℃进行，处理后分别于1、2、4、8和24h后取植株叶片，利用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存备用；

步骤六：芹菜RNA提取试剂盒提取芹菜总RNA，然后按照反转录试剂盒操作说明进行cDNA的反转录；

步骤七：采用Bio-RadIQ5荧光定量PCR系统，在96孔板中进行荧光定量PCR反应，选用芹菜Actin作内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。

2.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤一中，将LCY基因的隐马尔可夫模型作为输入文件进行检索，鉴定拟南芥、芹菜、香菜和胡萝卜中的LCY氨基酸序列，并使用TBtools从基因组中提取鉴定到的基因，将获得的序列放入NCBI数据库进行Blast检测，并命名。

3.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤三中，对三种蔬菜的分析是为了研究LCY基因在三个伞形科蔬菜作物的进化关系。

4.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤三中，确定最佳模型时，利用IQTREE软件使用最大似然法构建进化树，重复次数设置为1000，其它参数不变。

5.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤四中，通过Ka和Ks的比值可以同来衡量选择压力三种蔬菜的选择压力。

6.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤四中，先用ParaAT2.0软件对三个伞形科植物LCY基因的编码序列和核苷酸序列进行比对，然后利用KaKs_calculator2.0软件计算Ka、Ks和Ka/Ks值，模型设置为NG模型，当Ka/Ks＞1时，表示该基因对受到了正向选择，当Ka/Ks＜1时，表示该基因对受到了负选择，当Ka/Ks＝1时，表示该基因对受到了中性选择。

7.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤五中，选取长势一致的健康植株时，以蒸馏水喷灌作为对照组。

8.根据权利要求1所述的一种芹菜番茄红素ε-环化酶基因克隆及功能鉴定方法，其特征在于：所述步骤五中，高、低温处理的同时以200g/L的PEG6000溶液和200mmol/L的NaCl溶液浇灌芹菜植株模拟干旱和盐胁迫。