[发明专利]一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的方法，其特征在于：所述检测KRAS基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 1/SEQ ID 2，SEQID 3/ SEQ ID 4，SEQ ID 5/SEQ ID 6，SEQ ID 7/ SEQ ID 8，SEQ ID 9/SEQ ID 10，SEQ ID11/SEQ ID 12，SEQ ID 13/SEQ ID 14，SEQ ID 15/SEQ ID 16和SEQ ID 17/SEQ ID 18所示；所述检测BRAF基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 19/SEQID 20，SEQ ID 21/ SEQ ID 22，SEQ ID 23/SEQ ID 24，SEQ ID 25/ SEQ ID 26，SEQ ID27/SEQ ID 28和SEQ ID 29/SEQ ID 30所示；所述检测PIK3CA基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 31/SEQ ID 32和SEQ ID 33/ SEQ ID 34所示；所述检测EGFR基因突变的靶向扩增上游/下游引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 35/SEQ ID 36所示；以上所述引物对的5´端为通用引物对，其核苷酸序列如SEQ ID 37/SEQ ID 38所示。

2.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的SEQ ID 1-SEQ ID 38的混合引物对、靶向扩增缓冲液、文库扩增缓冲液、I5标签、I7标签、纯化磁珠。

3.根据权利要求2所述的靶向扩增缓冲液，其特征在于，所述靶向扩增缓冲液包括高保真DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合物、盐离子。

4.根据权利要求2所述的文库扩增缓冲液，其特征在于，所述文库扩增缓冲液包括高保真DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物。

5.一种基于多重PCR靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，提取人外周血、细胞、或新鲜组织基因组DNA；第二步，以提取的人外周血、细胞、或新鲜组织基因组DNA中的其中一种为模板，加入权利要求1所述的SEQ ID 1- SEQID 38的混合引物对，靶向扩增缓冲液和双蒸水，进行扩增目标区域PCR反应；第三步，采用磁珠对第二步中获得的PCR产物进行纯化，得到扩增子液体；第四步，在第三步中获得的扩增子液体中加入文库扩增缓冲液、I5标签、I7标签和双蒸水，进行PCR反应使扩增子两侧带上测序接头序列；第五步，采用磁珠对第四步中获得的PCR产物进行纯化，得到扩增子文库；第六步，对第五步所获得的扩增子文库进行测序和结果分析。

6.根据权利要求5所述的扩增目标区域PCR反应的步骤，其特征在于，所述扩增目标区域PCR反应步骤中，扩增目标区域的PCR反应体系为：总体积30微升，包含15微升靶向扩增缓冲液，1-400纳克基因组DNA，2微升浓度为0.1-0.5微摩尔每升的靶向扩增引物对混合物及适量双蒸水。

7.根据权利要求5所述的扩增目标区域PCR反应的步骤，其特征在于，扩增目标区域的PCR反应程序为：热盖温度设定为105摄氏度；首先95摄氏度预变性3分钟；其次95摄氏度变性20秒，60摄氏度退火/延伸30秒，15-45个循环；最后72摄氏度延伸5分钟。