[发明专利]一种高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法

权利要求书

1.一种高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)获得根际土壤样本微生物菌悬液

将采集到的健康生长的农作物根际样品室温下用活性保持型缓冲液超声处理10～40s，得到含有丰富微生物的根际微生物样品悬浮液，随后将根际微生物样品悬浮液过滤收集过滤液，获得根际土悬浮液，得到的根际土悬浮液在2～7℃保存备用；

超声条件为同时采用三种不同频率的超声波进行处理，所述超声波频率分别为15～30KHz、45～60KHz、80～100KHz；

所述活性保持型缓冲液包含5～9.5mM Na₂HPO₄，110～140mM NaCl，1～3mM KH₂PO₄，1～3.5mMKCl，3～7％小微球藻多糖，pH为6.5-7.5；

2)确定分离培养最适稀释浓度

将根际土悬浮液加入高通量分离液体培养基中，梯度稀释根际土悬浮液，获得浓度不同的根际土稀释液，在无菌操作下将不同浓度的根际土稀释液分别移入不同的96孔细胞培养板孔内培养，另取未添加根际土悬浮液的5～15％TSB溶液为阴性对照，每个样品设三个以上重复，将96孔细胞培养板封口放置于摇床上，28～37℃，80～180r/min培养2～10天；

96孔细胞培养板内有20～35％的孔内呈现肉眼可见浑浊状态，该96孔细胞培养板对应的根际土稀释液浓度作为分离培养的最适稀释浓度；

所述高通量分离液体培养基含有：50～150mg/L的L-色氨酸，10～30g/L酪蛋白多肽，10～30g/L大豆蛋白多肽，2-7g/L氯化钠，PH为6.0-8.0；

3)筛选产IAA单一菌株；

在无菌操作下将最适稀释浓度的根际土稀释液移入细胞培养板孔内，将细胞培养板封口放置在摇床上，28～37℃，80～180r/min培养培养2～10天；培养完成吸取细胞培养板孔内的浑浊菌液于白色陶瓷板，加入Salkowski显色液进行显色反应，同时以IAA标准液作为阳性对照；含有50-150mg/L的L-色氨酸，10-30g/L酪蛋白多肽，10-30g/L大豆蛋白多肽，2-7g/L氯化钠，PH为6.0-8.0的液体培养基溶液为阴性对照；白色陶瓷板置于室温，避光条件下放20～40min后观察，颜色变红者表示能够产生IAA；根据IAA显色反应的结果对产IAA的细胞培养板中的菌株进行编号保藏。

2.根据权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法，其特征在于，步骤1)中，超声处理时间为20～40s。

3.如权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法，其特征在于，步骤3)中，所述IAA标准液中，IAA的浓度为10～100mg/L。

4.如权利要求1所述的高通量分离植物根际微生物并培养筛选产IAA菌株的方法，其特征在于，所述农作物为青菜、番茄、生菜或菠菜。