[发明专利]一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置和方法

权利要求书

1.一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置，其特征在于，所述基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置包括激发模块、激活模块、成像模块，其中激发模块、激活模块含有单个微元可调的空间光调制器，激发模块整形出射的激发光线与激活模块整形出射的激活光线合并，得到合并光线，合并光线经放大后以纳米尺寸照射到样品上并通过成像模块进行成像。

2.根据权利要求1所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置，其特征在于，所述激发模块按照光路传播方向，依次包含：激光光源Ⅰ、扩束镜Ⅰ、均匀光透镜组Ⅰ、聚焦透镜Ⅰ、全内反射透镜Ⅰ、空间光调制器Ⅰ；扩束镜Ⅰ用于对激光光源Ⅰ发出的激发光线进行扩束；均匀光透镜组Ⅰ和聚焦透镜Ⅰ用于会聚激发光线；全内反射透镜Ⅰ将激发光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅰ中；空间光调制器Ⅰ对入射的激发光线进行整形并出射。

3.根据权利要求1所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置，其特征在于，所述激活模块按照光路的传播方向，依次包含：激光光源Ⅱ、扩束镜Ⅱ、均匀光透镜组Ⅱ、聚焦透镜Ⅱ、全内反射透镜Ⅱ、空间光调制器Ⅱ、二向色镜、准直透镜组、滤镜片转盘、物镜、载物台；扩束镜Ⅱ用于对激光光源Ⅱ发出的激活光线进行扩束；均匀光透镜组Ⅱ和聚焦透镜Ⅱ用于会聚激活光线，全内反射透镜Ⅱ激活光线以特定角度入射到空间光调制器Ⅱ中，激活光线经过空间光调制器Ⅱ整形后以特定角度入射到二向色镜上，与激发光线形成合并光线；滤光片转盘将合并光线反射到达物镜；合并光线经由准直透镜组和物镜的放大后以纳米尺寸照射到载物台上的样品上。

4.根据权利要求1所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像装置，其特征在于，所述成像模块按照光路的传播方向，依次包含：压电陶瓷电机、管镜、探测器；压电陶瓷电机实现轴向精密对焦；荧光在滤光片转盘发生透射，并经由管镜聚焦后进入到探测器中。

5.应用权利要求1～4任一项所述装置的一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)首先将样品放置于载物台上，由上位机控制空间光调制器Ⅰ所有微镜状态为“开”；然后粗调物镜相对载物台的位置，使探测器成像达到较好清晰度；再由压电陶瓷电机细调物镜相对载物台的位置，使探测器成像达到最优清晰度；

2)根据ROI区域的位置信息与形状信息，控制空间光调制器Ⅰ，将激发光线整形为几何形状Ⅰ；控制空间光调制器Ⅱ，将激活光线整形为几何形状Ⅱ；其中几何形状Ⅰ和几何形状Ⅱ的位置可以是包含、相交或者互斥的关系；

3)由荧光定位算法和单个微元可调的空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ，实现对几何形状Ⅰ、几何形状Ⅱ中心位置的实时调整；并通过持续迭代中心位置来记录ROI区域的荧光分子；

4)由步骤3)得到几何形状Ⅰ和Ⅱ的中心位置所记录的在ROI区域荧光分子的位置；并且所述荧光分子发出的荧光经由滤光片转盘透射、管镜聚焦后被探测器获取并进行成像。

6.根据权利要求5所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法，其特征在于，所述空间光调制器Ⅰ、空间光调制器Ⅱ是单个微元可调的空间光调制器，包括但不限于DMD或透射式LCD。

7.根据权利要求5所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法，其特征在于，在迭代中心位置时几何形状Ⅱ包含于几何形状Ⅰ；几何形状Ⅱ和几何形状Ⅰ包括但不限于是甜甜圈形、矩形或三角形等。

8.根据权利要求5所述一种基于空间光调制的纳米精度荧光成像方法，其特征在于，所述荧光定位算法在定位的过程中，通过控制空间光调制器Ⅰ和Ⅱ形成光斑并投射到样品区域内，再然后调整空间光调制器Ⅰ和Ⅱ，不同位置微镜的开关使光斑以随机开始的位置为圆心、L＝600nm为直径的圆周上移动完成一次迭代，完成迭代后缩小直径L进行下一次迭代，不断重复上述操作，迭代至直径L＝60nm时结束，并最终确定荧光分子所在位置，迭代过程中荧光分子距离最近的光斑中心点的距离r可表示为：

其中，表示是估计值，MLE表示是最大似然法，最大似然估计值的结果近似表示为在迭代中荧光分子距离最近光斑中心点的概率的多项式分布如下式所示：

其中是甜甜圈光斑移动过程中探测器收集到的光子数的集合；N是单次迭代过程中收集光子的总数；n₀！…n_k-1！是集合中的元素，代表单次迭代中，每一次移动几何形状Ⅰ、Ⅱ时收集到的光子数；k是单次迭代过程中空间光调制器Ⅰ、Ⅱ控制几何形状Ⅰ、Ⅱ中心位置移动的次数；p_i是向量参数，其中λ_i表示几何形状Ⅰ引起的背景噪声的波长，λ_bi表示几何形状Ⅱ引起的背景噪声的波长。