[发明专利]一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法

说明书

本发明公开了一种适合饲料高温制粒的内切β‑葡聚糖酶的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种适合饲料高温制粒的内切β‑葡聚糖酶的构建方法，包括目的基因扩增；酶切、连接和转化；利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；采用Ni‑NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化。本发明通过定向进化，得到一个具有高度热稳定性的β‑葡聚糖酶，比酶活为91.6U/mg，在90℃半衰期为1.5h，该酶在饲料领域应用具有巨大潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法。

背景技术

β-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，以右旋葡萄糖为基本单位，属于多糖类中的同多糖类，具有线型的空间结构，存在于禾谷类(大麦、燕麦、黑麦和小麦)的糊粉层和胚乳细胞壁中。β-葡聚糖酶对β-葡聚糖具有重要的水解作用，能使其降解为低分子量片段。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切和外切两类；包括纤维素酶、昆布多糖酶、β-葡聚糖昔酶、内切β-1，3-葡聚糖酶、外切β-1，3-葡聚糖酶、内切β-1，2-葡聚糖酶、内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶和内切β-1，6-葡聚糖酶。在所有这些酶中以β-1，3-1，4-葡聚糖酶最为活跃。

内切型β-葡聚糖酶是纤维素酶类的重要成分之一，主要降解纤维素长链分子中的β-1，4-糖苷键。通过促进饲料中的纤维素降解，增加饲料中营养的吸收效率。

在非瘟流行的时候，选用高温制粒的饲料，可以大幅度地降低非瘟对猪养殖的影响。高温制粒对养殖猪用的酶提出了要求，要求饲喂的酶在经过高温制粒以后，仍然具有较高的酶活性。这就要求，适合饲喂的酶为具有高度热稳定性的酶。

因此，提供一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，具体步骤如下：

(1)目的基因扩增

以Primer-F和Primer-R为引物，以合成的β-葡聚糖酶基因序列SEQ ID NO.1为模板进行PCR扩增，获得目的基因；

(2)酶切、连接和转化

将步骤(1)获得的目的基因和pRSFduet-1表达载体分别进行双酶切，经连接，获得质粒pRSFduet-1-SQ，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞；

(3)利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；

(4)采用Ni-NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化，分析酶活性。

进一步，步骤(1)所述Primer-F和Primer-R的引物序列如下：

Primer-F：5’-GGGATCCATGCGTTCTCTGCC-3’；SEQ ID NO.3；

Primer-R：5’-CGAATTCTTAATGATGGTGGT-3’；SEQ ID NO.4。

进一步，步骤(2)所述双酶切所用的酶为BamH I和EcoR I。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种适合饲料高温制粒的内切β-葡聚糖酶的构建方法，本发明通过定向进化，得到一个具有高度热稳定性的β-葡聚糖酶，比酶活为91.6U/mg，在90℃半衰期为1.5h，该酶在饲料领域应用具有巨大潜力。

具体实施方式